2. 中国科学院大学, 北京 100049;
3. 复旦大学生物医学研究院, 上海 200032
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China ;
3. Institutes of Biomedical Sciences, Fudan University, Shanghai 200032, China
蛋白质的糖基化修饰是最常见、最重要的蛋白质翻译后修饰之一，它在蛋白质折叠、寄主病原相互作用等生命活动中起到了关键作用，而且糖蛋白也是主要的药物作用靶点和临床标志物之一[1-2].糖蛋白的质谱分析可以追溯到1978年，Morris等[3]利用电子碰撞(EI)和化学电离(CI)技术，并结合埃德曼降解方法，分析出了一种南极鱼类的某些抗冻糖蛋白.早期的糖蛋白质谱鉴定方法的历史脉络可以参考前人的综述[4-9].随着蛋白质组学分析技术和计算技术的发展，尤其是串联质谱技术的快速发展，人们开始关注糖蛋白的组学分析，因此出现了蛋白质组学的子领域——糖蛋白质组学[9].糖蛋白质组学更关注的研究点是对蛋白质的糖基化修饰进行规模化分析，从而可以从全局的角度研究各种糖蛋白在生命活动中所扮演的角色和所起的作用[10].质谱技术已经成为糖蛋白质组学分析的主要手段，一些综述对近几年的糖蛋白质谱分析方法进行了总结[11-15].
作为最主要的蛋白质糖基化修饰之一，N-糖基化是糖基化修饰分析的热点内容.N-糖基化修饰主要发生在氨基酸序列模体“天冬酰胺-X-丝氨酸/苏氨酸(N-X-S/T)”的天冬酰胺上，极少量发生在“天冬酰胺-X-半胱氨酸(N-X-C)”的天冬酰胺上(其中X可以是除脯氨酸以外的任意氨基酸).与天冬酰胺相连接的糖链以五糖核心为基础，一般有三种糖型：高甘露糖、混合型和复杂型.目前基于质谱技术的糖蛋白质组学是沿袭自鸟枪法蛋白质组学，所以要鉴定糖蛋白，需要先鉴定糖肽.与常见的简单翻译后修饰不同，糖链的多样性使得糖肽的鉴定非常复杂，一条蛋白质上可能会连接有数十到数百条糖链，常规的肽段鉴定搜索引擎无法搜索如此多的可变修饰.糖肽上的糖链本身也容易被串联质谱碎裂，且糖链的碎裂能量与肽段不尽相同，如果用简单的质谱技术，我们很难在一张串联质谱图中同时观察到丰富的糖链碎片和肽段碎片，所以有时需要综合使用多种技术，才有望达到规模化完整糖肽鉴定的目的[13, 16].近几年，尤其是2010年后，串联质谱技术有了显著发展，N-糖蛋白质组学技术也有了长足的进步[17].研究人员纷纷开发出了各种质谱方法进行规模化完整N-糖肽的鉴定，包括用N-糖酰胺酶(PNGase)切除糖链与不切糖链结合的方法、用碰撞诱导裂解(CID)或高能碰撞裂解(HCD)技术鉴定糖肽上的糖链，或者用电子运转裂解(ETD)技术鉴定糖肽上的肽段，有些方法采用的是HCD与ETD联用技术，或CID与三级质谱碎裂结合的技术进行糖肽的鉴定等等.
本文就近几年，特别是2010年后发展起来的N-糖蛋白质组学的质谱解析方法进行综述：首先简要介绍了N-糖肽的不同质谱碎裂模式；然后根据不同的碎裂模式，对近几年发展起来的多种N-糖肽鉴定的质谱解析方法进行了介绍；最后对当前糖蛋白质组学质谱解析方法所存在的问题进行了总结，并且展望了未来的发展方向.
1 N-糖肽的质谱碎裂与肽段的串联质谱鉴定一样，N-糖肽样品经过质谱的二级碎裂后得到实验二级谱图，然后实验二级谱图与糖肽的理论碎片离子进行匹配或者进行从头测序，从而鉴定出N-糖肽样品中的肽段序列和糖链结构.
图 1展示了常见的糖肽的理论碎片离子，包括糖肽的b/y、c/z离子和Y离子等，以及这些离子对应的化学键断裂位置和命名规则.目前糖肽糖链部分的鉴定主要用的是糖肽的Y离子，其含义可参照表 1，本文中用到的其他名称也可以参考表 1.
由于单糖-单糖之间连接的糖苷键与氨基酸-氨基酸之间连接的肽键的键能等理化性质不同，导致糖链的碎裂与肽段的碎裂有较大差别.下面我们就最常见的商用质谱仪中的碎裂模式：CID(基于共振激发的离子阱低能量CID)、HCD和ETD，对糖肽碎裂进行简要介绍.
1.1 N-糖肽的CID碎裂理论上，糖肽的Y离子和b/y离子在CID碎裂下是可以观测到的.这里的CID特指基于共振激发的离子阱低能量CID，它有两个特点：a.存在1/3效应；b.碎裂能量低，而且激发碎裂的共振频率只针对母离子质荷比窗口[18-19].所谓1/3效应，是指由于离子阱物理结构和仪器设置的原因，谱图中小于母离子质荷比28%的碎片离子不能由离子阱检测到，由于糖肽的分子质量一般都比较大，所以会丢失不少碎片离子.另外由于CID采用的是共振激发的低能量碎裂，被激发共振的只有母离子质荷比窗口内的离子，窗口外的离子不会被激发碎裂，因此当糖肽碎裂以后，碎片离子就“跳出了”激发窗口，导致糖肽只发生一次碎裂，不再发生二次碎裂.于是低键能的糖苷键优先碎裂，而肽键就不再碎裂，所以在CID谱图中较容易 观察到Y离子，但是很难观察到肽段碎片离子.如图 2a所示，糖肽VVLHPJYSQVDIGLIK+Hex5HexNAc4NeuAc2(我们为了方便区分，将糖基化位点N改成了字母J)在CID碎裂以后，低质荷比区域的碎片离子极 少(1/3效应)，而且除了极少量低强度的b/y离子(图 2a中的b8、b11离子)，其他高强度的碎片离子都是糖肽的Y离子.由于Y离子较为丰富，因此CID可以鉴定糖链部分，但是因为缺少肽段碎片离子，所以CID很难独立完成对完整糖肽的鉴定.
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| Fig. 2 CID, HCD and ETD MS/MS of an N-glycopeptide. a. CID; b. HCD; c. ETD 图 2 N-糖肽的CID、HCD和ETD谱图.a、CID；b、HCD；c、ETD |
1.2 N-糖肽的HCD碎裂
糖肽在HCD中碎裂的化学键与CID是完全相同的，所以它们的碎片离子类型也完全相同，然而它们的碎裂环境却完全不同.因为HCD不是由共振激发碎裂，所以比CID更容易发生二次碎裂，在糖苷键断裂后，二次碎裂就有可能产生肽段的碎片离子.HCD的另外一个好处是它利用轨道阱检测离子，克服了离子阱检测的1/3效应，从而能够检测到低质荷比区域的离子.因此我们在HCD谱图中可以观察到糖肽的氧鎓离子.图 2b展示了糖肽VVLHPJYSQVDIGLIK + Hex5HexNAc4NeuAc2的HCD碎裂谱图，其中糖肽的氧鎓离子非常明显，例如质荷比为138、204、366和657等碎片离子.除了氧鎓离子之外，HCD下糖肽的Y离子碎片明显比CID下的Y离子碎片要少一些，不过它们依然是HCD谱图中的主要离子，而且更多的b/y离子能够在HCD谱图中出现.研究表明如果加大HCD的碎裂能量，则肽段的碎片离子会有所增多[20].随着人们对糖肽HCD谱图认识的不断加深，HCD越来越受到糖肽鉴定流程设计者的青睐[21-22].基于四级杆-飞行时间(QTOF)的CID碎裂模式与HCD基本相同，理论上所有基于HCD的糖肽鉴定方法都可以用在QTOF-CID上，反之亦然.
1.3 N-糖肽的ETD碎裂ETD的碎裂与CID/HCD完全不同，它主要断裂的化学键为N-Cα键[23]，所以一般认为ETD主要碎裂的是糖肽肽段部分的N-Cα键，产生糖肽的c/z离子.理想情况下，ETD能够产生丰富的糖肽c/z离子，此时糖链并不碎裂，如同一个完整修饰一样连接在糖基化位点上.图 2c展示了糖肽VVLHPJYSQVDIGLIK + Hex5HexNAc4NeuAc2的ETD谱图，谱图中能观察到高质荷比的c11、z13、c14等离子，它们就是由没有碎裂的完整糖链连接在带有糖基化位点的肽段碎片上得到的.另外由于氢重排现象，图 2c中还可以观察到大量的z+H和c-H离子，这一点与纯肽段的ETD碎裂一致[23-24]. ETD的一个缺点是其碎裂效率受到母离子电荷与母离子质荷比等因素的制约[25-26]，例如图 2c中的母离子(即图 2c中的M离子)及其同位素峰簇的谱峰强度很高，说明大部分糖肽母离子都没有充分碎裂.人们也试图采用提高糖肽带电能力的方法以提高ETD的碎裂效率[27-28].另外ETD需要的反应时间较长，导致单位时间内的谱图产出率比CID或HCD低.虽然ETD比之CID和HCD有自身的缺点，但是ETD能够提供较好的糖肽肽段部分的碎片离子信息，所以目前依然是糖肽鉴定的重要手段之一.
2 N-糖肽质谱鉴定流程不同的碎裂模式提供了不同的碎片离子信息，人们根据这些信息进行了质谱流程设计，以便能够同时鉴定糖肽的糖链部分和肽段部分.图 3展示了主流的N-糖肽鉴定的质谱解析流程，主要包括切糖链和不切糖链两个方面.
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| Fig. 3 The overview of N-glycopeptide identification pipelines and software tools 图 3 N-糖肽鉴定流程及其软件概览 |
在介绍质谱解析方法之前，我们先介绍如何判定一张谱图是否为糖肽谱图.
2.1 N-糖肽二级谱图的筛选为了提高N-糖肽鉴定的准确性，需要从所有谱图中筛选出糖肽谱图，使得糖肽鉴定能够避免肽段谱图的干扰，从而提高鉴定的可靠性.糖肽谱图的筛选有通过母离子判定和通过二级谱图判定两种方式.
用母离子判定糖肽的方法就是直接判定一级谱的母离子谱峰信号是否为糖肽.IsoTag方法在培养细胞时加入含叠氮的单糖作为糖链自然合成的原料，而糖蛋白上的叠氮会与二溴(Br)化的硅烷探针(dibrominated biotin probe)发生反应，从而在糖链上引入了成对的溴元素.由于自然状态下，溴的同位素的丰度接近相等(79Br：81Br = 1：1)，所以发生二溴化修饰的母离子会存在一个三元组的质量标签，即M：(M + 2)：(M + 4) = 1：2：1，通过判断母离子信号的三元组质量标签，就可以判断该母离子是否为糖肽母离子[29].另外一种通过母离子判断糖肽的方法利用的是糖肽与非糖肽母离子质量的差异信息.由于糖链的氧元素比较多，所以糖肽母离子的质量与其取整质量之间的差和非糖肽是不同的(氧原子的分子质量为15.99 u，比它取整后的分子质量16略小，而氢原子和氮原子都比它们取整后的分子质量略大，碳原子的分子质量与取整后的质量相等).利用这一点，文献[30]通过模拟实验，得到了一个可以区分糖肽母离子与肽段母离子的简单分类器，它在实际数据上可以达到89%以上的灵敏度和93%以上的特异性.不过此方法要求糖肽的糖链比较大，如此糖肽分子中氧原子才会比较多，可区分性较强.
目前最常用的方法是通过HCD(或QTOF-CID)二级谱图中的氧鎓离子判断谱图是否为糖肽谱图.本文对常见的氧鎓离子进行了收集和总结，如表 2所示.在N-糖肽谱图的氧鎓离子中，一般强度最高的为204和366两种离子，它们分别是HexNAc和Hex + HexNAc的单电荷形式，有时138谱峰也是强度最高的氧鎓离子之一，它是HexNAc某种跨环碎裂的碎片离子的单电荷形式.现在所有的基于HCD和QTOF-CID的鉴定软件在设计时，或多或少都会根据204和366(或138)谱峰判断谱图是否为糖肽谱图.
2.2 切糖链的N-糖肽鉴定流程
N-糖肽的糖链可以用N-糖酰胺酶进行酶切，使得糖链从天冬酰胺N上切除，留下的N脱酰胺后变成天冬氨酸D(D的分子质量 = N的分子质量 + 0.984 u)，如果切糖链是在H218O中完成的，那么该分子质量差就变成2.988 u.我们对切糖链后的肽段样品进行常规的质谱鉴定，如果鉴定结果中合理的糖基化位点N上发生了脱酰胺修饰，则认为这个N是切糖链后得到的糖基化位点，从而完成糖肽肽段部分的鉴定[17].接着需要进行糖肽糖链部分的鉴定，其鉴定是不需要切除糖链的，可以直接将(富集后的)完整糖肽样品进行CID或者HCD碎裂，而后用从头测序或者糖库搜索的方法鉴定糖链.复旦大学杨芃原/张扬团队开发的GRIP使用的是糖链从头测序方法鉴定糖链[31].他们先利用切糖链后鉴定到的去糖基化糖肽构建了肽段库(本文中去糖基化糖肽或去糖基化肽段指的是糖肽经切除糖链后剩下的肽段部分，而糖肽指的是完整糖肽)，然后基于此肽段库进行糖链组成的从头测序鉴定，并且利用HCD的氧鎓离子筛选糖肽谱图，最后用Y1和0,2X0离子验证糖链鉴定的正确性.中国科学院大连化学物理研究所邹汉法/叶明亮团队开发的ArMone 2.0也是基于切糖链流程的N-糖肽鉴定软件[32].他们首先根据HCD谱图的氧鎓离子筛选糖肽谱图，然后利用糖链数据库Glycome-DB[33]和糖肽的HCD谱图进行匹配，利用糖肽的五糖核心Y离子确定糖链，并且推断出糖肽的肽段质量.他们发现相同的肽段序列，加糖链和不加糖链的保留时间相差不大，所以他们结合保留时间信息，将推断出的肽段质量与去糖基化的糖肽进行了匹配.GPQuest则采用了不同的切糖链鉴定策略[34]，根据切糖链鉴定得到的肽段结果建立一个肽段谱图库.在糖肽经过HCD碎裂以后，他们利用糖肽的Y0、Y1、0,2X0和Y2等离子与谱图库中的肽段母离子匹配确定肽段质量，其他糖肽肽段的理论碎片离子与谱库中的碎片离子匹配以鉴定糖肽的肽段，从而可以推断出糖链的质量.GPQuest将切糖链后得到的纯糖链进行质谱鉴定，得到可能的糖链组成表.最后将推断出的糖肽糖链质量与糖链组成表进行匹配，从而完成完整糖肽的鉴定.
N-糖肽的切糖链鉴定流程能够达到较高的鉴定通量.但是去糖基化的糖肽是通过脱酰胺修饰鉴定的，用它来百分之百确定糖肽的肽段部分可能存在风险[35]，我们不能排除生物体内或者处理样品时天冬酰胺自身引入的脱酰胺修饰对切糖链鉴定造成的影响.为了避免这个问题，人们开发了针对N-糖肽的固相萃取方法，该方法在切糖链之前加入苯胺与天冬氨酸进行反应，使天然的天冬氨酸加入了苯胺修饰，则切糖链后的没有苯胺修饰的天冬氨酸可以认为是N-糖基化位点[36].
然而即使能够解决切糖链后引入的位点误判问题，根据糖链质量推断糖链的方法依然存在一个难以避免的风险，即假如两个糖链质量相等，仅靠质量是难以区分二者的.例如只靠质量是不能区分Hex1NeuAc1与dHex1NeuGc1的，因为Hex1NeuAc1与dHex1NeuGc1的化学式完全一样，它们质量也完全相等.同理，根据糖肽的肽段质量去匹配肽段库的方法也可能存在同样的缺陷.因此如果可行，对于糖肽的鉴定，不切糖链是更为可靠的方法.
2.3 不切糖链的N-糖肽鉴定流程不切糖链的N-糖肽鉴定流程指的是直接将完整N-糖肽样品进行质谱分析鉴定的流程.根据同一个母离子是否产生多张二级谱图，该流程可以分为一母一谱和一母多谱两种模式，下面我们进行详细讨论.
2.3.1 一母一谱的N-糖肽鉴定流程一母一谱的糖肽鉴定就是同一个母离子只产生一张二级谱图(CID、HCD或者ETD谱图)，然后直接通过对该谱图的解析完成一条糖肽的鉴定.该流程对前期实验的要求较低，质谱流程也较为简单，但是对软件的要求比较高.Protein Prospector[37]在HCD谱图中筛选出糖肽谱图以后，它先开放式地鉴定糖肽的ETD谱图，而后将开放式搜索得到的意外修饰质量认为是候选的糖链质量，通过查糖链质量表得到糖链的组成.Byonic将糖链组成库作为可变修饰搜索糖肽的ETD或者HCD谱图以鉴定肽段，也具备类似功能.GlycoPep Detector[38]也支持糖肽ETD谱图鉴定，它预先生成了糖肽组合然后计算出所有糖肽的理论c/z离子，接着去匹配ETD谱图.GlycoPeptideSearch(GPS)[39-40]在对糖肽的QTOF-CID谱图进行搜索时，除了考虑肽段的b、y离子外，还考虑了糖链的Y1、Y2和Y3离子，以确定肽段质量和糖链质量，最后糖链质量与Glycome-DB糖库匹配得到糖链组成.
利用QTOF-CID谱图同时鉴定糖链与肽段的软件主要有两款：GlycoPeptide Finder(GPFinder)[41] 和MAGIC[42].GPFinder是针对非特异酶切糖肽的QTOF-CID谱图所设计的软件，它对糖链的鉴定并不是根据糖链质量推断的，它同时考虑了QTOF-CID谱图中的糖链碎片和肽段碎片，根据Y离子糖组成的合法性过滤掉不合理的Y离子，然后设计了一种同时考虑糖链碎片与肽段碎片的打分方法以同时鉴定糖肽.MAGIC采取了较为不同的鉴定策略.它首先根据(Y0 —NH3,Y0,Y2)或(Y0,Y1,Y2)谱峰三元组确定糖链质量和肽段质量，然后用0-1背包模型对糖链碎片离子的匹配进行建模以鉴定糖链组成.完成糖链组成的鉴定后，MAGIC删除了二级谱图中所有糖链碎片离子，并且将二级谱图母离子质量改成肽段质量，最后用常规的蛋白质搜索引擎鉴定肽段.
目前，一母一谱存在的最大问题是有时单张谱图提供的碎片离子信息有限，不足以同时鉴定糖链和肽段.结合图 2我们可以看到，CID或者HCD可以提供丰富的糖肽糖链碎片离子，但是肽段的碎片离子还不够丰富，虽然ETD可以碎裂肽段，但是它没有提供糖链碎片离子的信号.所以在谱图碎片离子信息不够的情况下，利用一母一谱鉴定糖肽的流程还具有较大的改进空间.
2.3.2 一母多谱的N-糖肽鉴定流程在当前常规质谱条件下，单种碎裂提供的谱图信息有时不足以同时鉴定糖肽的糖链和肽段，所以需要综合多种碎裂的信息以达到完整糖肽鉴定的目的.当前有一些质谱仪提供了一个母离子顺序完成两种或者两种以上碎裂的功能，使得基于一母多谱的N-糖肽鉴定成为可能.
比较常用的一母多谱的碎裂模式为HCD + ETD，其中HCD提供了氧鎓离子以判断谱图是否糖肽，而后还可以进行糖链的鉴定，而ETD则可以提供肽段的碎片离子以鉴定肽段.近几年，由于仪器提供了碎片离子触发(product-dependent)的功能，使得一母多谱的技术更加方便了用户.母离子进行HCD碎裂以后，仪器能够根据用户设定的氧鎓离子是否出现来判断母离子是否为糖肽，进而触发该糖肽母离子的ETD碎裂，此模式称为HCD-pd-ETD[43-44].由于ETD反应时间较长，离子触发技术能够避免ETD的反应时间浪费在非糖肽样品上.GlycoMasterDB可以支持HCD + ETD碎裂模式的糖肽鉴定，如果只有HCD谱图，则它只给出糖链组成的鉴定结果，而肽段需要人工解析[45].由于HCD提供的糖链碎片离子信息可能不如CID丰富，所以人们也开发了一母三谱的糖肽鉴定模式，即CID + HCD + ETD.目前支持此三组合碎裂的软件为GlycoFragwork[46]，它用从头测序的方法在CID谱图上推测糖链结构，用ETD鉴定肽段，而HCD则提供了氧鎓离子以判断糖肽谱图以及糖链类型.如果没有ETD谱图，GlycoFragwork或者软件GlypID 2.0[47]也可以只利用CID + HCD完成糖肽的鉴定，但是此时肽段就只能通过肽段质量匹配得到.GlycoFinder[48]则使用低能量的HCD代替CID以鉴定糖链组成，并且使用高能量的HCD鉴定糖肽的肽段.
另一种一母多谱的N-糖肽鉴定流程为Sweet-Heart[49-50]，它首先建立了一批基于低精度CID的糖肽标注数据集，接着考虑糖链碎片的序列标签、N-糖肽的五糖核心离子和匹配谱峰强度等特征，训练得到一个随机森林模型.而后Sweet-Heart用该模型对糖肽低精度CID谱图的糖链组成进行预测，从而可以推断出肽段的可能质量，再用靶向三级谱(targeted-MS3)的方式碎裂并且鉴定肽段，进一步确认糖链预测结果，最后糖链与肽段都完成了鉴定.这种方式并不是传统的一母多谱，因为目标三级谱实验必须在糖链预测之后进行，需要额外进行一次质谱实验，所以这种方式的自动化程度不够高.后来Sweet-Heart又发展了另外一种流程，即Sweet-Heart for HCD[51]，它利用HCD谱图中的Y0/Y1或Y1/Y2离子二元组推测出Y1离子的质量，然后将谱图的母离子质量改成Y1离子的质量，再用常规的蛋白质搜索引擎鉴定修改后的谱图得到肽段，而糖链依然可以依靠CID谱图上的随机森林模型进行预测，最终结合CID和HCD完成完整糖肽的鉴定.当然该流程也可以额外配合HCD/ETD谱图的开放式肽段搜索以鉴定 肽段.
文献[51]用Sweet-Heart for HCD流程的鉴定结果与Byonic的糖肽鉴定结果进行比较并且手工验证后，发现虽然Byonic报告的鉴定结果的错误率为0%，但是它实际错误率却高达37%，他们认为造成高假阳鉴定的主要原因是Byonic缺少对糖链鉴定的错误率控制，说明了对于完整糖肽的鉴定，只针对肽段部分进行错误率控制是不够的.
我们通过切糖链和不切糖链两种流程的对比可以看出，除了利用质量匹配可能降低切糖链流程鉴定结果的可靠性外，这两种流程的另一个区别主要体现在肽段部分的鉴定上.在一般的切糖链流程中，去糖基化的糖肽会与非糖肽样品混合在一起进入质谱进行二级碎裂，由于缺少像氧鎓离子这样的谱图特征去区分去糖基化糖肽与非糖肽谱图，因此所有的谱图都需要搜索同时包含糖肽肽段和非糖肽肽段的蛋白质序列数据库，这会引起两种错误鉴定，导致错误鉴定的可能性增加：a. 去糖基化的糖肽谱图被鉴定成了非糖肽的肽段；b. 非糖肽谱图被鉴定成了去糖基化糖肽.所以总体上讲，不切糖链的流程天然保留了糖链连接位点的信息，它的鉴定结果更容易被研究人员所接受.
2.4 N-糖肽中核心岩藻糖的鉴定流程核心岩藻糖化的N-糖基化是非常重要的一类N-糖基化修饰[52-54]，设计专门针对核心岩藻糖鉴定的流程是非常有意义的.带有核心岩藻糖的糖肽会被内切糖苷酶(endoglycosidase)F3切成“肽段 + HexNAc1dHex1”形式的糖肽.基于此，军事医学科学院-北京蛋白质组研究中心的钱小红/应万涛团队开发了一系列核心岩藻糖的鉴定流程.在早先的带线性离子阱CID的质谱仪上，由于共振激发与低能量碎裂的原因，核心岩藻糖很容易断裂，形成高强度的“肽段 + HexNAc1”谱峰，但是肽段不容易碎裂，所以在“肽段 + HexNAc1”谱峰与谱图母离子之间存在一个固定的146 u质量差(dHex质量为146 u)，根据此质量差触发三级碎裂，接着可以用pFind(http://pfind.ict.ac.cn)对该三级谱图进行搜索鉴定，得到“肽段 + HexNAc1”，从而推断出“肽段 + HexNAc1dHex1”的形式[55].后来该团队通过解析谱图发现，低能量的HCD与线性离子阱一样只能碎裂得到“肽段 + HexNAc1”谱峰，而中等能量的HCD碎裂则可以得到肽段的碎片，高能量的HCD碎裂则可以产生丰富的氧鎓离子.于是他们利用仪器提供的阶梯能量碎裂功能，将低、中、高能量的HCD碎裂到一张谱图上，从而可以完成高通量的核心岩藻糖化修饰肽段的鉴定，并且由常规肽段鉴定的质控方法进行质控[56].在用技术重复保证可靠性的前提下，他们在78 min的梯度上能够完成鼠肝样品的1 364条核心岩藻糖化肽段的鉴定.该流程的缺点就是它只能鉴定核心岩藻糖化 修饰的肽段，但是无法鉴定核心岩藻糖化的完整 糖链.
上述不少流程的分析软件都可以免费下载，有些甚至是源代码开放的.我们在表 3中列出了相关软件的下载链接.
3 总结与展望
虽然目前存在诸多糖肽质谱解析方法，但是不同方法得到的鉴定结果其可靠性是不同的，我们将之分为4个层次，分别为：
a. 完整糖肽的二级谱图用于鉴定糖链，肽段靠质量进行匹配.单通过质量不能确定糖肽谱图的肽段，例如肽段ACDEFK和FEDCAK的质量是完全相等的.蛋白质组学研究结果表明，如果仅靠肽段质量而没有二级谱碎片离子的匹配打分信息还不足以达到“鉴定”的目标.此问题主要出现在切糖链流程上，该流程只根据谱图推测得到的肽段质量与切糖链鉴定的肽段进行匹配得到肽段结果.
b. 完整糖肽的二级谱图用于鉴定肽段，糖链靠质量进行匹配.与层次a类似，仅靠质量有时也无法区分一些糖链组成，例如Hex5HexNAc4NeuAc1dHex1和Hex6HexNAc4NeuGc1是同时存在于自然界的糖组成，但是二者的质量是完全相等的，所以也需要糖链的二级谱碎片离子信息来区分.许多软件都只通过糖肽谱图推测出糖链质量，然后匹配糖组成库，比如GPQuest、Protein Prospector、Byonic和GPS等等.
c. 完整糖肽的二级谱图同时用于糖链和肽段的匹配打分，但是缺少糖链鉴定的错误率估计.大部分基于QTOF-CID(或HCD)和一母多谱的流程都能在糖肽谱图中同时鉴定糖链和肽段，而且可以用基于肽段的目标诱饵库模型进行肽段鉴定的错误率估计，例如GlycoFragwork、GlycoMaster DB、MAGIC和GlycoPep Evaluator[57]等，然而它们依然没有专门考虑糖链鉴定的错误率.
d. 完整糖肽的二级谱图同时用于糖链和肽段的匹配打分，而且同时具有糖链和肽段鉴定错误率控制的机制.目前只有基于QTOF-CID的GPFinder单独考虑了糖链鉴定的错误率，它利用糖链加11 u建立诱饵糖链，从而使用目标诱饵库模型以估计糖链鉴定错误率[41].如果加上肽段的目标诱饵库策略，则可以同时估计肽段和糖链的错误率.当然该方法目前只使用在简单样品中，如果要用在复杂体系中，则需要优化模型以得到更可靠的错误率估计结果.
对于多数流程，其鉴定可靠性的不足主要来自糖肽解析软件的不足，其中一个主要因素是解析软件缺少同时针对糖链和肽段的错误率估计机制.对于未来的糖肽鉴定软件，我们还是希望它的可靠性能够达到层次d，只有肽段和糖链的鉴定可靠性同时得到了保证，后期的生物学分析才更加有意义.
除了可靠性，糖肽鉴定还存在一些问题需要解决：a.通量问题.虽然该流程不能鉴定完整糖链，但是钱小红/应万涛团队的核心岩藻糖鉴定流程能够在78 min的梯度上完成鼠肝样品上1 364条核心岩藻糖化肽段的鉴定.而在同时控制糖肽的肽段和糖链错误率的前提下，目前的完整糖肽鉴定流程很难达到相同的鉴定通量.b.糖结构库的完整性问题.由于我们对糖基转移酶的研究还处于探索阶段，所以糖链在生物体内的合成还未发现模板，现在使用的大部分糖结构都是由生物化学研究人员从实验中得出的，例如Glycome-DB.然而在实际应用中我们也许希望鉴定到新的糖链结构，以发现新的功能.从头测序也许是解决方案之一[58]，但是用从头测序方法推测糖链结构是极为困难的[59].所以如何生成合理、完整的理论糖结构库是需要解决的问题之一.c.精确的糖结构鉴定.即使有了糖链结构库，也并不意味着我们就能够精确地鉴定糖链的结构，例如单糖与单糖的六圆环之间存在连接位点，只利用Y离子信息是无法得到六圆环连接位点信息的.此时鉴定软件需要挖掘更加精细的糖肽碎片离子信息，以辅助推断单糖与单糖之间的连接位点，然后推测出更加精确的糖链结构.d.软件的易用性、软件的速度和糖肽谱图的自动标注等都是糖肽解析软件需要考虑的问题，文献[60]对这方面的需求进行了很好的综述.
另外在蛋白质糖基化修饰中，O糖也是人们关注的一类糖基化修饰，但是其高通量的鉴定流程与软件却不如N-糖基化的丰富，而且我们在实际研究中发现，一条肽段上经常有两个甚至两个以上位点都发生了O糖基化修饰，文献[61]也报道了羟基赖氨酸O糖基化的多修饰位点问题，这给鉴定带来更大的挑战.肽段也可能发生多位点上的N-糖基化修饰，但是实际研究中我们发现该现象还没有那么普遍.
近几年随着糖科学越来越受到人们关注，作为糖科学分支的糖蛋白质组学也有了不小的进展.2014年美国国家卫生研究院专门设立了基金以支持糖生物学、糖化学方法的研究和糖软件工具的开发，而国内的一些研究机构也正不断地推进糖蛋白质组学的研究.相信在国内外糖生物学家、糖化学家和生物信息学家的共同努力下，不仅质谱流程会更加高效，软件工具也会更加简单易用，最终上述问题将会得到有效解决.
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