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奶牛与水牛初乳中乳寡糖组分比较研究
孟宪璞1, 焦思明2, 秦胜旗1, 杨贤蓓1, 李建设1, 未金花2, 王倬2, 杜昱光2     
1. 首都医科大学附属北京友谊医院,北京 100050;
2. 中国科学院过程工程研究所,北京 100190
摘要: 乳寡糖是由乳汁中含量丰富的固体物质组成.研究结果表明,乳寡糖有提高免疫、益生元及抗感染等作用,已发现与婴儿肠道发育、神经智力发育等多方面关系密切.水牛奶是除牛奶外的第二大奶源,国际上公认其为营养含量高、口感好的优质乳制品,但目前针对水牛乳寡糖的研究多以美洲水牛为研究对象,尚无中国水牛的相关研究.本研究利用固相萃取对已脱脂和除去蛋白质的广西水牛初乳乳汁样品进行纯化,并采用苯胺(aniline,Bn)衍生化试剂对其进行衍生化处理,通过UPLC-ESI-Q-TOF-MS液相质谱进行优化后,对水牛初乳中的寡糖组分进行测定并与牛乳进行了对比,最终测得奶牛初乳中19种及水牛初乳中的9种乳寡糖组分,并对二者的种类及含量进行比较,发现在两种初乳的乳寡糖中,中性糖二糖m/z 385.15和中性糖三糖m/z 547.21以及酸性糖m/z 635.23均为其主要寡糖成分,与其他乳寡糖相比含量相对较高.总体而言水牛初乳中的中性寡糖占比比奶牛初乳高,二者中性糖占乳寡糖总量的比例分别为88.88%和63.16%.
关键词: 乳寡糖     初乳     奶牛     水牛     UPLC-ESI-Q-TOF-MS    
Comparative Study on Milk Oligosaccharides in Buffalo and Cow Colostrum Milk
MENG Xian-Pu1, JIAO Si-Ming2, QIN Sheng-Qi1, YANG Xian-Bei1, LI Jian-She1, WEI Jin-Hua2, WANG Zhuo2, DU Yu-Guang2     
1. Beijing Friendship Hospital Affiliated to The Capital University of Medical Sciences, Beijing 100050, China;
2. Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100095, China
** Corresponding author: DU Yu-Guang, Tel: 86-10-82545070, E-mail: ygdu@ipe.ac.cn
Received: July 19, 2017 Accepted: August 28, 2017
Abstract: Milk oligosaccharides, which are free oligosaccharides in the mammalian milk, is one of the main composition in milk. Recent studies suggested that milk oligosaccharides improved immune function, and showed prebiotics as well as anti-infection actives. Milk oligosaccharides is also important for the intestinal development, neural development of infants. Buffalo (Bubalus bubalis) milk is the second important milk source besides cow milk. It was also well accepted that buffalo milk was rich in nutritional content and was a high quality dairy product with good taste. However, researches on buffalo milk oligosaccharides was limited and only worked on American buffalo. On the other hand, milk oligosaccharides on Chinese buffalo is lacking. In the present study, colostrum milk samples from Guangxi buffalo were purified with solid phase extraction and modified by Aniline (Bn) derivative reagent. The sample was further purified by UPLC-ESI-Q-TOF-MS. The oligosaccharide components in buffalo colostrum were determined and compared with the cow colostrum milk. 19 kinds of oligosaccharides were found in cow colostrum and 9 in buffalo colostrum. Moreover, in both two kinds of colostrum, neutral disaccharide m/z 385.15, neutral trisaccharide m/z 547.21 and acidic oligosaccharide m/z 635.23 were the main composition. In general, the proportion of neutral oligosaccharides in buffalo milk was higher than that in cow milk, with a ratio of 88.88% and 63.16%, respectively.
Key words: milk oligosaccharides     colostrum milk     cow     buffalo     UPLC-ESI-Q-TOF-MS    

乳寡糖是哺乳动物乳汁中游离低聚糖,是由乳汁中含量丰富的固体物质组成,研究结果表明,乳寡糖能够通过调节肠道菌群刺激有益菌快速生长,从而提高新生儿免疫力、作为益生元维持肠道微生物的平衡、通过抵御病原微生物的入侵从而实现抗感染的作用,减少新生儿腹泻、脑膜炎等疾病的发生[1-2].由于人乳、牛乳以及其他哺乳动物中的乳汁寡糖具有明显的生物活性从而被广泛的研究.

在哺乳动物细胞中合成乳寡糖是一个复杂的过程,每一个单糖是根据特定的糖基转移酶有顺序地进行添加的.它们形成以乳糖和乳糖胺为核心单元,以半乳糖、N-乙酰氨基己糖胺、唾液酸或岩藻糖作为修饰单元,以不同糖苷键连接的复杂化学结构[3-4].由于乳寡糖具有重要的生物学功能,因此对乳寡糖复杂结构的分析研究十分必要.但因从乳汁样品中分离纯化得到的寡糖大部分为乳糖,其余乳寡糖含量都很少且结构复杂多样,这就给乳寡糖的糖链结构分析带来挑战.目前在糖组学研究中,不断开发出新的方法来研究其结构和功能活性之间的关系,而在这些方法中,质谱因其灵敏度和快速等优势被认为是表征寡糖结构的最有效手段之一[5-6].

水牛奶是除牛奶外的第二大奶源,国际上公认其为营养含量高、口感好的优质乳制品,其干物质含量高达18.44%,而普通牛奶一般是13%,乳脂率为7.94%,而普通牛奶一般是3%~3.5%[7].然而,水牛乳汁中的乳寡糖含量却鲜有人研究.本文采用UPLC-ESI-Q-TOF-MS液质分析方法,比较奶牛初乳与水牛初乳中乳汁寡糖的组分及含量的异同,同时与美洲水牛乳中的乳寡糖组成进行比较.

1 材料与方法 1.1 试剂与材料

水牛(地中海奶水牛)初乳由广西华胥水牛繁育有限公司提供,牛初乳由中国农业科学院饲料所提供;SPE固相萃取柱Extrac CleanTM Carbo.150 mg/4 ml购自Grace Davison Discovery Science公司;质谱纯乙腈购自Thermo Fisher公司;其余试剂均为分析纯,购自国药化学试剂公司.

1.2 乳汁样品脂肪与蛋白质去除

取0.5 ml初乳样品和0.5 ml去离子水充分混匀, 12 000 r/min离心30 min,吸取中间清液400 μl,转移到2 ml离心管中;加入氯仿:甲醇(2:1) 1 600 μl充分混匀,12 000 r/min离心30 min;吸取上清500 μl,加入无水乙醇1 ml充分混匀,静置于4℃冰箱12 h,12 000 r/min离心30 min去除沉淀;吸取上清转移到圆底烧瓶,旋转蒸馏浓缩至干燥.

1.3 乳汁样品纯化

将干燥后的乳寡糖样品溶于2 ml水中,上样至活化后的SPE柱上,用3倍柱体积水清洗除杂质,再分别用3 ml 25%乙腈和3 ml 25%乙腈(含0.5%三氟乙酸)进行洗脱,并将洗脱液收集冻干.

1.4 乳寡糖的衍生化修饰

将上述分别冻干的两份样品混合溶于100 μl水中,取50 μl苯胺(d0或d5),50 μl乳寡糖样品,50 μl NaCNBH3(1 mol/L NaCNBH3的30%冰醋酸溶液),金属浴中设定70℃,衍生化反应20 min取出冷却到室温.

将衍生后的乳寡糖样品用水稀释至2 ml,上样至活化后的SPE柱上,用5倍柱体积水清洗除杂质,再分别用3 ml 30%乙腈和3 ml 30%乙腈(含0.5%三氟乙酸)进行洗脱,并将洗脱液收集冻干.

1.5 乳寡糖样品分析前准备

定性分析:将冻干样品(d0或d5) 溶于30 μl液相起始流动相中,各取5 μl,共10 μl进行液相质谱分析.

定量分析:将冻干样品(d0) 溶于30 μl液相起始流动相中,取15 μl,加入0.5 μl环糊精(0.1 g/L), 取10 μl进行液质分析.

1.6 UPLC-ESI-Q-TOF-MS液相质谱分析方法

采用Waters ACQUITY UPLC系统(Waters Corp.,Milford,MA,USA)对乳寡糖样品进行定性和定量分析,色谱柱选用Acquity UPLC BEH Amide column (1.7 μm,2.1 mm × 150 mm;Waters Corporation,Milford,MA,USA).流动相为10 mmol/L甲酸铵水溶液(A)和10 mmol/L甲酸铵乙腈溶液(B),流速为0.3 ml/min.洗脱程序为:0~2 min (B: 100%~100%),2~32 min (B: 100%~60%),32~33 min (B: 60%~20%)并保持3 min,随后梯度用1 min恢复到(B: 100%),并保持7 min等待下一次进样.进样体积10 μl,柱温箱温度40℃.

质谱采集系统采用Waters SynaptTM mass spectrometer (Waters Corp.,Milford,MA,USA),离子化采用ESI正离子模式.质谱参数为:毛细管电压3.0 kV;锥孔电压60V;源温150℃;脱溶剂温度500℃.质谱采集使用MSE(Mass Spectrometry ElevatedEnergy)模式,一级质谱设置参数(function 1) 为:m/z 100~3 000,扫描频率:0.25 s,碰撞能量3eV;二级质谱设置参数(function 2) 为:m/z 100~ 3 000,扫描频率:0.25 s,碰撞能量20~50eV.数据采集使用MassLynxTM 4.1软件(Waters Corp., Milford,MA,USA),数据处理采用GlycoWorkbench.1.1.3480糖质谱数据处理软件.

2 结果与讨论 2.1 奶牛初乳与水牛初乳中乳寡糖组成分析

采用MassLynxTM 4.1软件对苯胺d0与d5标记过的两种乳汁样品中的寡糖分别进行一级质谱分子离子峰的双峰衍生确认和二级质谱碎片的验证(图 1).再通过GlycoWorkbench糖质谱数据处理软件定性分析后表明,两种样品中的寡糖无论从数量和种类都存在差异,如表 1所示.

Fig. 1 Mass spectrum of milk oligosaccharide in the colostrum of cow(a) and buffalo(b)with a d0 and d5 aniline label
Table 1 Comparison of milk oligosaccharide components in the colostrum of cow and buffalo

目前文献报道中已发现奶牛乳中含有50种乳寡糖,其中的34种已经通过糖链连接方式、单糖类型及组成等几方面对其结构进行了确证.相对于奶牛乳寡糖而言,水牛乳中乳寡糖就鲜有报道,Hyeyoung Lee等[8]研究发现,美洲水牛乳中含有13种乳汁寡糖组分,但未发现任何一种乳寡糖是以岩藻糖或Neu5Gc来修饰的,唯一的酸性寡糖均是以Neu5Ac修饰的.

我们的研究中也发现类似的情况,在奶牛初乳中发现的乳寡糖共有19种,其中中性糖12种,包括以岩藻糖修饰的1种,酸性糖7种,包括以Neu5Ac修饰的5种和以Neu5Gc修饰的2种.而地中海奶水牛初乳中总共发现9种乳寡糖,其中中性糖8种,未发现以岩藻糖修饰的寡糖,酸性糖仅1种,是以Neu5Ac修饰的三糖,也并未发现以Neu5Ac修饰的乳寡糖.这种差异可能与奶牛和水牛乳腺中分泌酶的类型及其活性有较大关系[9].再对地中海奶水牛与美洲水牛乳寡糖组分进行比较可见,美洲水牛乳中m/z 675.250,m/z 749.290,m/z 796.280,m/z 1041.380,m/z 1115.420,m/z 1365.493这6种寡糖组分未在地中海奶水牛初乳寡糖组分中发现,且大多为以Neu5Ac修饰的乳寡糖.

2.2 奶牛初乳与水牛初乳中乳汁寡糖组成含量比较

采用MassLynxTM 4.1软件对两种乳汁寡糖样品中的各种寡糖分别进行分子离子峰提取,并通过积分面积计算各寡糖与内标物环糊精的相对含量比值,如图 2中所示.

Fig. 2 Comparison of the abundance of milk oligosaccharide in the colostrum of cow and buffalo

图 2中可见,两种初乳样品中都存在的乳寡糖里,奶牛初乳中的m/z 547.21、m/z 708.26的相对含量高于水牛初乳,而水牛初乳中的m/z 385.15、m/z 424.089、m/z506.18、m/z 870.32、m/z 911.34这几种乳寡糖组分的相对含量则明显高于奶牛初乳,二者中的唾液酸乳糖组分m/z 635.23的相对含量基本相当.

将两种乳寡糖中的相对含量最多的5种寡糖分别筛选出来进行比较,如图 3中所示.奶牛初乳中相对含量排名前5的乳寡糖组分分别为:m/z 547.21、m/z 749.29、m/z 635.23、m/z 385.15、m/z 426.176,其占乳寡糖总量比例分别为:52.22%、9.96%、9.85%、9.11%和4.77%.水牛初乳中相对含量排名前5的乳寡糖分别为:m/z 385.15、m/z 506.18、m/z 635.23、m/z 547.21、m/z 424.039,其占乳寡糖总量比例分别为:41.16%、34.57%、8.67%、6.90%和5.78%.通过比较可知,两种乳寡糖中m/z 385.15、m/z 547.21、m/z 635.23均为其主要寡糖成分,唾液酸乳糖的含量无论在奶牛初乳还是水牛初乳中都排在第三位,含量相对较高.另外经过对比后还发现m/z 424.039磷酸化修饰的乳糖在地中海奶水牛乳寡糖组分中占比远高于奶牛乳,这种差异也许会对其生物活性有较大影响.

Fig. 3 Milk oligosaccharide Top 5 in the colostrum in cow(a)and buffalo(b)
3 结论

本研究通过对广西地中海奶水牛乳寡糖组分研究分析,发现了9种质核比的乳寡糖,与文献报道的美洲水牛乳寡糖组分进行对比发现,二者在总体乳寡糖构成方面较为一致,均以中性糖为主要组成,酸性糖含量相对较少,且酸性糖中仅有以Neu5Ac修饰的乳寡糖.二者在乳寡糖组分数量上有一定差别,地中海奶水牛中乳寡糖组分数量略少于美洲水牛.

本研究还发现,在广西地中海奶水牛乳初乳和奶牛乳初乳的乳寡糖中,中性糖二糖m/z 385.15和中性糖三糖m/z 547.21以及酸性糖m/z 635.23均为其主要寡糖成分,与其他乳寡糖相比含量相对较高.此外,从总体而言地中海奶水牛初乳中的中性寡糖占比比奶牛初乳高,二者中性糖占乳寡糖总量的比例分别为88.88%和63.16%.中性乳寡糖在人乳、牛乳、羊乳等哺乳动物乳汁中都大量存在,但目前国内外对其活性研究的报道相对较少.此外,已有研究报道表明,乳寡糖含量的高低与动物营养有着密切的关系[10],而中性寡糖与酸性寡糖的高低是否也与动物营养有着相应的联系,这都有待进一步的研究.本文研究结果中表明水牛乳寡糖中性寡糖含量占比较高,因此对水牛乳寡糖的的进一步分离纯化并开展生物学功能活性评价,将有利于对上述问题进行更深入的探究.

参考文献
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中国科学院生物物理研究所和中国生物物理学会共同主办
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孟宪璞, 焦思明, 秦胜旗, 杨贤蓓, 李建设, 未金花, 王倬, 杜昱光
MENG Xian-Pu, JIAO Si-Ming, QIN Sheng-Qi, YANG Xian-Bei, LI Jian-She, WEI Jin-Hua, WANG Zhuo, DU Yu-Guang
奶牛与水牛初乳中乳寡糖组分比较研究
Comparative Study on Milk Oligosaccharides in Buffalo and Cow Colostrum Milk
生物化学与生物物理进展, 2017, 44(10): 942-948
Progress in Biochemistry and Biophysics, 2017, 44(10): 942-948
http://dx.doi.org/10.16476/j.pibb.2017.0301

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收稿日期: 2017-07-19
接受日期: 2017-08-28

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