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耻垢分枝杆菌宿主整合因子(IHF)对DNA拓扑结构的影响
陈媛媛1,2, 张先恩1,3 , 毕利军4     
1. 中国科学院生物物理研究所,生物大分子国家重点实验室,北京 100101;
2. 中国科学院大学,北京 100049;
3. 中国科学院生物大分子科教融合卓越中心,北京 100101;
4. 中国科学院生物物理研究所核酸生物学重点实验室,北京 100101
摘要: 结核分枝杆菌(Mycobaterium tuberculosis)是结核病的病原菌,每年导致数百万人死亡.对于分枝杆菌基本生物学特性的研究有助于新的药物及治疗手段的研发.耻垢分枝杆菌(M. smegmatis)是分枝杆菌属中的一种非致病菌,与结核分枝杆菌亲缘关系较近,是实验室常用的研究分枝杆菌的模式菌种.分枝杆菌主要编码三种染色质蛋白,类组蛋白HU、Lsr2和宿主整合因子IHF.为研究IHF在染色体包装中的作用,我们在大肠杆菌中表达、纯化了耻垢分枝杆菌IHF蛋白(MsIHF),并对其影响DNA拓扑结构的性质进行了系统分析.体外研究的结果表明,MsIHF以同二聚体的形式存在,其对负超螺旋DNA具有一定的结合偏好性,同时,该蛋白可以有效地固定DNA负超螺旋.进一步的研究表明,MsIHF可以调控拓扑异构酶的活性.MsIHF的结合明显地抑制拓扑异构酶Ⅰ的松弛活性,而与此相反,该蛋白可以轻微地促进旋转酶引入DNA负超螺旋的能力.以上结果提示,MsIHF可能通过调控拓扑异构酶的活性影响染色体DNA的结构,进而调控其包装.
关键词: 分枝杆菌     宿主整合因子     DNA结合蛋白     DNA超螺旋     DNA拓扑异构酶    
Effects of Integration Host Factor (IHF) From Mycobacterium smegmatis on DNA Topological Structure
CHEN Yuan-Yuan1,2 , ZHANG Xian-En1,3 , BI Li-Jun4     
1. National Laboratory of Biomacromolecules, Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China;
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
3. CAS Center for Excellence in Biomacromolecules, Beijing 100101, China;
4. Key Laboratory of RNA Biology, Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China
*This work was supported by grants from The Chinese Academy of Sciences (KJZD-EW-TZ-L04, XDPB0305) and The National Natural Science Foundation of China (U1401224)
** Corresponding author: ZHANG Xian-En. Tel: 86-10-64888148, E-mail: zhangxe@ibp.ac.cn
BI Li-Jun. Tel: 86-10-64888464, E-mail: blj@ibp.ac.cn
Received: July 11, 2017 Accepted: October 13, 2017
Abstract: Mycobacterium tuberculosis is the pathogen of tuberculosis which causes about millions people death annually. M. smegmatis, as a type of non-pathogenic strain of Mycobacterium closely related to M. tuberculosis, is the most studied model strain in laboratory. Mycobacterium encodes three types of chromatin proteins, i.e. histone-like protein HU, Lsr2 and integration host factor (IHF). To investigate the functional roles of IHF in chromosomal DNA organization, we expressed and purified IHF protein from M. smegmatis (MsIHF) in Escherichia coli, and analyzed the effects of MsIHF on DNA topology in vitro. MsIHF exists as a stable homodimer in solution. MsIHF exhibits preferred binding to negatively supercoiled DNA rather than linear or relaxed DNA. This protein is also capable of constraining negative DNA supercoils. Further analyses showed modulations of topoisomerase activities by MsIHF in vitro. MsIHF obviously inhibits the relaxation of supercoiled DNA by topoisomeraseⅠ from E. coli. By contrast, this protein slightly stimulates E. coli gyrase to introduce negative supercoils into relaxed DNA. These data suggests that MsIHF may alter the topological structure of chromosomal DNA through modulation of the activities of topoisomerases, and therefore regulates the organization of chromosome.
Key words: Mycobacterium     integration host factor     DNA binding protein     DNA supercoiling     DNA topoisomerase    

染色质蛋白在所有细胞生物中均发挥着至关重要的作用,它们负责在压缩包装基因组DNA的同时调控DNA复制、修复及转录过程中分子机器与基因组DNA的互作.在细菌细胞中存在着多种DNA结合蛋白(例如,HU、IHF、H-NS、Fis及Lrp等),这些蛋白质共同将染色体DNA包装成为一个有序的结构——拟核[1-2].这些蛋白质具有不同程度的序列特异性,通过弯折、桥联或者缠绕DNA行使包装功能[3].此外,一些染色质蛋白还起到了全局性的转录调控功能,缺失这类蛋白往往导致多效性的表型变化[2-4].大肠杆菌(Escherichia coli)中的多种染色质蛋白的性质和功能,包括IHF、HU以及H-NS等,已得到了深入的研究.H-NS通常结合在富含AT的基因间区,调控两侧基因的表达[5].该蛋白也可以与远处结合的H-NS分子聚合,有效地连接相距较远的DNA片段[6].HU蛋白是异二聚体,不具有序列特异性,可以促进DNA弯折及缠绕[3, 7].IHF也是异二聚体,与HU蛋白的结构具有较高的同源性,其结合可以明显地造成DNA弯折,然而该蛋白通常结合在特异的DNA序列,例如细菌基因组(attB位点)及噬菌体DNA上的整合位点(attP位点)[8].

不同的细菌门中染色质蛋白的种类及功能具有明显的多样性.其中放线菌(包括链霉菌及分枝杆菌等)编码HU的类似蛋白但缺少明显的IHF或H-NS的同源蛋白.近期的研究表明,分枝杆菌含有一类H-NS的同功蛋白——Lsr2[9].而在结核分枝杆菌(Mycobaterium tuberculosis)与耻垢分枝杆菌(M. smegmatis)也发现了一类具有促进噬菌体DNA整合的活性蛋白,因此命名为mIHF[10-11].与E. coli IHF相似,该蛋白是一种小分子、热稳定的蛋白,倾向于结合弯曲DNA,且可以与噬菌体整合酶以及attP DNA形成稳定的复合物[10-11].与E. coli IHF相似,mIHF的胞内含量在对数后期以及进入静止期时达到最大[12-13].然而,2种蛋白在一级序列及二级结构上没有明显的相似性,二者的DNA序列偏好性也明显不同,而且前者不能取代mIHF的胞内功能[13].值得注意的是,mIHF对M. smegmatis的存活是必需的[12],同时该蛋白似乎对M. tuberculosis的生长也很重要[14].这些结果表明mIHF在分枝杆菌胞内的功能不仅止于噬菌体DNA整合,而很可能在染色体组织包装中发挥作用.

近期,对M. tuberculosis编码的mIHF蛋白(MtIHF)的研究结果显示[11],MtIHF在体外可以促进DNA压缩成为类似拟核的结构或者高级的纤维状结构,且该活性依赖于其偏好序列在DNA上的位置.另外,对与mIHF亲缘关系较近的Streptomyces coelicolor IHF(sIHF)的研究表明,sIHF对该菌的染色体凝集以及生孢过程中的染色体分离具有十分重要的作用[15],sIHF可以在体内和体外影响拓扑异构酶的活性,并明显改变DNA的拓扑结构[15].超螺旋有助于DNA的凝集以及高级结构的形成,而影响DNA拓扑结构是染色质蛋白的特点之一.然而,mIHF对DNA拓扑结构的影响仍不清楚.

M. tuberculosis基因组中注释的MtIHF比来源于M. smegmatis的mIHF蛋白(为与MtIHF进行区别,命名为MsIHF)多出了一个长约85个氨基酸的N端结构域[11, 16],其余序列同源性非常高(图 1).但也有研究表明在M. tuberculosis H37Rv胞内的天然MtIHF不含有N端结构域[17].最近的研究表明N端结构域的缺失对MtIHF的活性没有影响[18].因此对MsIHF的研究有助于对mIHF生理功能的理解.在本研究中,我们对MsIHF对DNA拓扑结构的影响进行了系统的研究.结果显示,MsIHF在溶液中以同二聚体的形式存在,虽然其对不同拓扑形式的质粒DNA亲和力相近,但该蛋白可以有效地固定DNA负超螺旋.进一步的研究表明,MsIHF明显地抑制拓扑异构酶Ⅰ的活性,推测该蛋白在体内可能参与调控染色体DNA的超螺旋状态,进而调节染色体的结构.本研究的结果不仅为证实mIHF参与染色体包装提供了直接的证据,而且有助于揭示mIHF参与DNA包装的分子机制.

Fig. 1 Sequence alignment of selected IHF homologues Sequences are from E. coli(IHFa, b1712; and IHFb, b0912), M. smegmatis(MsIHF, MSMEG_3050), M. tuberculosis(MtIHF, Rv1388) and S. coelicolor (sIHF, Sco1480). The secondary structures of IHFa (PDB code: 2IIE) and sIHF (PDB code: 4ITQ) are indicated.
1 材料与方法 1.1 蛋白质表达与纯化

以耻垢分枝杆菌基因组DNA为模板,利用引物(F1:5′ TAATCATATG GCCCTTCC CCAGTT-GAC和R1:5′ TAATCTCGAG TTACGACTGGT-CGAACTTC)PCR扩增MsIHF的编码基因片段,克隆至表达载体pET-28a的NdeⅠ-XhoⅠ位点,并转化大肠杆菌感受态细胞BL21.在LB培养基中大量培养菌体,在培养物A600达到0.6时加入终浓度为0.4 mmol/L的IPTG诱导表达,37℃继续培养3 h后,6 000 r/min离心10 min收集菌体.细胞重悬于缓冲液A(Buffer A:20 mmol/L Tris-Cl pH 8.0, 500 mmol/L NaCl,10 mmol/L Imidazole),超声破碎细胞,10 000 r/min离心15 min,收集上清.将裂解液上清上样至以Buffer A预平衡的Histrap HP柱(GE Healthcare),用Buffer A清洗10个柱体积,以洗脱缓冲液B(Buffer B:20 mmol/L Tris-Cl pH 8.0,500 mmol/L NaCl,250 mmol/L Imidazole)梯度洗脱蛋白.收集含有MsIHF蛋白组分,透析至缓冲液C(Buffer C:20 mmol/L Tris-Cl pH 6.8,50 mmol/L KCl,1 mmol/L EDTA)中,使用Hitrap SP柱(GE Healthcare)进行进一步分离、纯化,以洗脱缓冲液D(Buffer D:20 mmol/L Tris-Cl pH 6.8,1 mol/L KCl,1 mmol/L EDTA)梯度洗脱蛋白.收集含有MsIHF蛋白组分,透析至Buffer C中备用,SDS-PGE检测蛋白质纯度.

1.2 分子筛凝胶过滤层析

使用HiLoad10/300 Superdex 75柱(GE healthcare)对纯化的MsIHF蛋白进行分子尺寸排阻色谱分析.取100 μl MsIHF蛋白样品(1 mg)上样到以Buffer C预平衡的分子筛柱,流速为0.5 ml/min,A280检测蛋白洗脱.层析柱的空体积(vo)和柱体积(vt)分别利用蓝葡聚糖和二甲基蓝进行测定.MsIHF蛋白分子的保留体积可以通过公式Kav = (ve-vo)/(vt-vo)进行计算,其中ve为洗脱峰体积.在相同条件下,利用低分子质量蛋白质标准(GE healthcare)标定该分子筛柱,分别计算Kav,对lgMr作标准曲线,然后通过该曲线计算MsIHF蛋白的分子质量.

1.3 琼脂糖凝胶阻滞实验

分别制备超螺旋(supercoiled,Sc)、线性(linear,L)以及松弛环状(relaxed,R)的质粒pBR22 DNA,按照1:1:1的比例混合.按不同蛋白/ DNA质量比(0,0.25,0.5,1.0,2.0,4.0,8.0,16.0)将MsIHF与150 ng的DNA混合,室温孵育15 min.以1%的琼脂糖凝胶在1×TAE中电泳分析蛋白质-DNA复合物,凝胶在溴化乙锭溶液(0.5 mg/L)中染色,紫外光下成像.

1.4 切刻-闭环实验

切刻-闭环实验参照文献中方法进行[19]:利用切口酶Nb. Bpu10Ⅰ(Fermentas)按照说明书条件处理超螺旋pBR322制备仅含有单个切刻位点的pBR322 DNA.每个反应取0.2 μg单切刻DNA,分别与不同量的MsIHF蛋白混合(蛋白/DNA质量比分别为0,0.25,0.5,1.0,2.0,4.0,8.0,16.0), 体系中含有1×T4连接酶反应缓冲液(40 mmol/L Tris-Cl pH 7.8,10 mmol/L MgCl2,10 mmol/L DTT,0.5 mmol/L ATP以及100 mg/L BSA),25℃下孵育15 min.向体系中加入T4 DNA连接酶(2U; Fermentas)启动连接反应,25℃下孵育5 min.然后加入5×终止缓冲液(250 mmol/L EDTA和2.5 % SDS)终止反应,并以0.5 g/L的蛋白酶K在55℃下除去体系中的蛋白.样品中DNA的超螺旋状态以1%的琼脂糖凝胶在1×TAE中进行电泳分析,凝胶在溴化乙锭溶液(0.5 mg/L)中染色,紫外光下成像.

1.5 DNA松弛与超螺旋实验

为检测MsIHF对拓扑异构酶Ⅰ(TopoⅠ;NEB)松弛超螺旋DNA活性的影响,0.3 μg超螺旋pBR322以1 U的TopoⅠ进行松弛(反应条件参照酶的说明书),反应中分别加入不同量的MsIHF蛋白(蛋白/DNA质量比分别为0,0.125,0.25,0.5,1.0),37℃下反应30 min.另外,以松弛的质粒pBR322为底物,检测MsIHF对旋转酶(gyrase;NEB)引入DNA负超螺旋活性的影响.反应体系中含有0.3 μg松弛的pBR322、gyrase以及不同量的MsIHF蛋白(蛋白/DNA质量比分别为0,0.125,0.25,0.5),37℃下反应30 min(反应条件参照酶的说明书).以上反应的终止、体系中蛋白的去除以及样品中DNA超螺旋状态的分析,参照1.4中方法进行.

2 结果 2.1 MsIHF在溶液中形成二聚体

序列比对的结果显示(图 1),mIHF蛋白与E. coli来源的2种IHF亚基(IHFa与IHFb)的序列相似性非常低,而与S. coecolor来源的sIHF同源性很高.其中,MsIHF与MtIHF的C端序列的一致性接近100%.由于有证据表明M. tuberculosis H37Rv胞内的天然MtIHF可能并不含有其基因组中注释的N端约85个氨基酸[17],因此可以推测MsIHF与MtIHF具有相同的生化性质及生理功能.同时值得注意的是,E. coli来源的IHF与S. coecolor来源的sIHF的二级结构之间区别非常明显,提示放线菌中的IHF蛋白可能具有较为独特的功能.

含有N端His标签(6×his)的重组MsIHF蛋白经镍柱亲和层析及阳离子交换层析纯化得到(图 2a).经SDS-PAGE检测,MsIHF蛋白呈现单一条带(纯度大于97%),其表观分子质量接近14 ku,与重组蛋白的理论分子质量(13349.41 u)相近.对该条带进行胶内酶解及肽指纹图谱分析的结果进一步确认该蛋白即为MsIHF(数据未显示).多数细菌中的IHF为异二聚体,而链霉菌及分枝杆菌则只编码一个IHF亚基.其中sIHF为单体形式[15],而MtIHF为同二聚体[11, 17].为确认MsIHF在溶液中的聚集形式,利用分子尺寸排阻层析测定了该蛋白在溶液中的分子质量(图 2b).层析结果显示,MsIHF在洗脱时形成单一的洗脱峰,根据标准曲线计算得到其分子质量约为26.6 ku,表明该蛋白在溶液中形成稳定的同二聚体.

Fig. 2 Characterization of purified MsIHF (a) Purified recombinant MsIHF sample was analyzed by SDS-PAGE through a 15% gel. The gel was stained with Commasie Brilliant Blue and imaged. (b) Gel filtration chromatography of MsIHF. The protein sample was loaded at an amount of ~1 mg in 100 μl, as described in"Materials and methods". The Y-axis represents the absorbance at 280 nm. Inset is the analysis of the gel filtration experiment shown in panel (b). The standard curve was generated by linear least squares regression analysis. Molecular weight markers (conalbumin, 75 ku; ovalbumin, 44 ku; carbonic anhydrase, 29 ku; ribonuclease, 13.7 ku; aprotinin, 6.5 ku) are indicated. The calculated molecular mass of the sample peak of MsIHF is also shown.
2.2 MsIHF结合DNA

我们进而利用琼脂糖凝胶阻滞实验分析了MsIHF与不同拓扑结构形式(负超螺旋、线性及松弛形式)的质粒pBR322 DNA的相互作用(图 3a).结果显示,随着蛋白量的增加3种形式DNA的迁移率均逐渐下降.事实上,在蛋白质浓度较低时(蛋白/DNA质量比为0.25;MsIHF二聚体浓度约为0.14 μmol/L)即可观察到3种形式的DNA均发生轻微的泳动减慢,表明MsIHF可以很好地结合3种DNA.而当蛋白质/DNA质量比提高为0.5时,线性DNA的条带变得不规则,可能是由于MsIHF的不均一结合所致.蛋白质/DNA质量比提高为1.0时,超螺旋DNA的条带呈弥散状(smear),推测MsIHF的结合改变了DNA的构象.当蛋白质/ DNA质量比高于2.0时,松弛与线性DNA的阻滞条带重合,表明此时二者与MsIHF所形成的复合物的结构可能十分相似.当质量比达到16.0时,阻滞条带均呈现规则、锐利的形态,且迁移率不再变化,这一结果提示,蛋白/DNA质量比在8左右时MsIHF在DNA上的结合接近饱和,此时蛋白质二聚体/DNA摩尔比约为848:1.鉴于pBR22 DNA的长度为4 361 bp,因此,可以估算出MsIHF在DNA上的最大结合密度约为5 bp/蛋白质二聚体.这一数值小于之前对其他细菌编码的IHF的报道[20-22],但却与sIHF-DNA复合物晶体中的DNA结合位点的大小(~4 bp)相似[15],这一点提示来自于放线菌的IHF可能具有独特的DNA结合模式.

Fig. 3 MsIHF binding to plasmid DNA in different forms (a) Agarose gel shift analysis of MsIHF binding to pBR322 DNA in supercoiled (S), linear (L) and nicked (N) forms. Protein/DNA mass ratios were 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8 and 16, respectively. (b) Binding curves for MsIHF binding to supercoiled, linear and nicked DNA. Each curve was an average of the data from three independent experiments.■—■: Nicked DNA; ●---● : Linear DNA; ▲………▲: Supercoiled DNA.

分别对3种形式的DNA电泳迁移率的变化对蛋白二聚体浓度作图(图 3b),发现迁移率的改变可以较好地反映DNA分子上MsIHF蛋白的结合数量.按照半数DNA被结合时的蛋白质浓度为解离常数这一定义,可以计算出MsIHF结合超螺旋、线性及松弛质粒DNA的解离常数(KD)分别约为0.8、1.2以及1.7 μmol/L.这一结果表明,与线性或松弛环状DNA相比,MsIHF倾向于结合超螺旋DNA.

2.3 MsIHF在体外固定DNA负超螺旋

多数染色质蛋白可以固定DNA负超螺旋,而我们的结果也表明MsIHF对超螺旋DNA具有一定的偏好.因此我们利用切刻-闭环实验检测了MsIHF固定DNA超螺旋的能力(图 4a).在反应体系中存在或不存在MsIHF的情况下,含有单一切口的质粒pBR322 DNA以T4 DNA连接酶进行连接,并以琼脂糖凝胶电泳检测DNA的超螺旋状态.需要指出的是,在25℃时,T4 DNA连接酶的连接产物在电泳中表现为轻度的正超螺旋而不是松弛形态.这可能是由于连接反应与电泳的实验条件(如,温度、离子强度等)的差别所造成的[23].而随着MsIHF蛋白浓度的增加,连接产物中的正超螺旋逐渐减少并转变为负超螺旋,继而负超螺旋数持续增加.这一结果表明MsIHF在体外可以有效地固定DNA负超螺旋.

Fig. 4 DNA nick-closure assays (a) MsIHF constrains negative DNA supercoils. Plasmid DNA containing a single nick was incubated in the presence of increasing amounts of MsIHF before ligation by T4 DNA ligase. Protein/DNA mass ratios were 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8 and 16, respectively. N, pBR322 with a single nick. (b) A plot of the negative linking number change against the protein/DNA mass ratio by linear fit with the software Origin 7.5. The linking number change of pBR322 nick closed in the presence or absence of MsIHF was measured by resolving plasmid topoisomers on an agarose gel, as shown in Figure 4a, and subsequent band counting. Each data point was an average of the data from three independent experiments.

pBR322 DNA连接产物的连环数(linking number)的变化可以通过条带计数得到,对蛋白/ DNA质量比作图(图 4b),线性拟合曲线的斜率即可表示MsIHF固定DNA超螺旋的效率.如图 4b所示,当质量比为1:1时(MsIHF蛋白二聚体与DNA的摩尔比约为106:1),MsIHF可以在每个DNA分子上大约固定3个DNA负超螺旋.也就是说,大约36个蛋白二聚体分子的结合固定1个负超螺旋.根据DNA结合实验的结果,当MsIHF的结合达到饱和时(pBR322分子上约结合848个MsIHF蛋白二聚体分子)大约可以在每个pBR322 DNA分子上固定约24个负超螺旋,而在切刻-闭环实验中蛋白质饱和时可计数的负超螺旋约为20个,与上述理论计算值相近.

2.4 MsIHF调控拓扑异构酶的活性

虽然MsIHF的结合可以直接改变DNA的拓扑结构,但在细菌胞内DNA的超螺旋水平主要由旋转酶以及拓扑异构酶Ⅰ来调控[24],因此我们进而分析了MsIHF对DNA拓扑异构酶活性的影响(图 5).由于高浓度的MsIHF会干扰TopoⅠ对旋转酶与DNA的结合(数据未显示),因此实验均在较低蛋白质浓度下进行(蛋白/DNA质量比小于1.0),在此条件下超过75%的底物DNA未被MsIHF所覆盖,基本不影响拓扑异构酶与DNA的互作.结果显示,MsIHF在体外实验中明显抑制TopoⅠ的松弛活性(图 5a).当反应体系中不存在MsIHF时,TopoⅠ可以将超螺旋质粒DNA完全松弛,而随着MsIHF浓度的提高,TopoⅠ的松弛活性也逐渐下降.值得注意的是,在相同的MsIHF浓度下,相比于切刻-闭环实验的结果,松弛实验中MsIHF蛋白所造成的连环数的改变要更加的明显.如图 5b所示,当蛋白/DNA质量比为0.5时,DNA产物与松弛DNA的负连环数之差约为6,而在切刻-闭环实验中,相同浓度的MsIHF固定的负超螺旋数小于2.这一区别提示MsIHF对TopoⅠ活性的影响不完全缘于其固定的负超螺旋,可能还存在其他互作机制.

Fig. 5 MsIHF modulated the activities of topoisomerases in vitro (a) MsIHF inhibits DNA relaxation by topoisomeraseⅠ from E. coli. Negative supercoiled plasmid DNA was relaxed by E. coli TopoⅠ in the presence of increasing amounts of MsIHF. Protein/DNA mass ratios were 0, 0.125, 0.25, 0.5 and 1.0, respectively. R: Relaxed circular DNA; S: Negatively supercoiled DNA. (b) A plot of the negative linking number change against the protein/DNA mass ratio. The linking number change of pBR322 relaxed by TopoⅠ in the presence or absence of MsIHF was measured by resolving plasmid topoisomers on an agarose gel, as shown in Figure 5a, and subsequent band counting. Each data point was an average of the data from three independent experiments. (c) MsIHF stimulates the supercoiling activity of gyrase from E. coli. Relaxed plasmid DNA was relaxed by E. coli TopoⅠ in the presence of increasing amounts of MsIHF. Protein/DNA mass ratios were 0, 0.125, 0.25 and 0.5, respectively. R: Relaxed circular DNA; S: Negatively supercoiled DNA.

与TopoⅠ的情况不同,MsIHF可以轻微地促进旋转酶的活性(图 5c).当反应体系中不存在MsIHF时,旋转酶可以在松弛的质粒DNA上引入负超螺旋,形成一系列含有负超螺旋的拓扑异构体条带;随着反应体系中MsIHF浓度的提高,可以观察到电泳迁移率较慢的拓扑异构体条带逐渐减少,可以推断MsIHF促进了旋转酶引入DNA负超螺旋的活性.虽然本实验中由于产物中多数DNA分子的负超螺旋程度很高,无法通过电泳条带计数来准确计算其DNA连环数的变化,但根据该变化比较细微这一事实,可以推测MsIHF对旋转酶活性的促进可能主要来自于其固定DNA负超螺旋的活性.

3 讨论

细菌中的拟核相关蛋白通常具有两种主要的生理功能:其一,将染色质DNA包装、折叠形成拟核;其二,调控细胞中重要基因的表达.由于这类蛋白质在胞内的含量丰富且具有较低的序列偏好性,它们一般通过调整DNA结构来进行转录调控[2, 25].Mycobacterium编码3种主要的拟核相关蛋白——HU、Lsr2以及mIHF.其中Lsr2和mIHF仅在放线菌中保守.mIHF与其他细菌所编码的IHF的序列相似性很低(图 1),因此研究mIHF的生理功能有助于揭示分枝杆菌独特的生物学性质.

本研究在体外系统分析了MsIHF对DNA拓扑结构的影响,发现MsIHF倾向于结合超螺旋DNA,且可以固定DNA负超螺旋.此前的研究表明,MtIHF的C端结构域(与MsIHF高度同源的结构域)可以在质粒DNA上形成不同角度的弯折[17],而全长的MtIHF同样表现出缠绕和弯曲短片段DNA的能力[11],这可能是MsIHF固定DNA负超螺旋的机制.本研究还发现MsIHF可以在体外调节拓扑异构酶(尤其是TopoⅠ)的活性,而这种调控不完全归结于其固定DNA负超螺旋的能力,提示MsIHF可能通过某种未知的机制直接或间接地影响TopoⅠ的松弛活性.此前的研究显示,M.tuberculosis编码的HU蛋白(MtHU)可以通过直接与TopoⅠ的相互作用来促进其活性[26].需要指出的是,MtHU的调控特异性针对MtTopoⅠ,而不影响E. coli来源的TopoⅠ(EcTopoⅠ),而MsIHF则可以有效地抑制EcTopoⅠ的松弛活性,说明MsIHF可能并非通过与TopoⅠ的互作而影响其活性.虽然mIHF蛋白家族成员的长度具有多样性,但均具有保守的C端结构域.而近期研究则表明,MtIHF蛋白的C端结构域与全长蛋白质的生化性质基本一致[18],因此对MsIHF的研究可以帮助理解mIHF蛋白家族的生理功能.值得注意的是,mIHF对分枝杆菌的生长是必需的[12, 14],说明在分枝杆菌细胞内mIHF对染色体DNA的组织包装是必需的.而HU和mIHF对拓扑异构酶活性的不同影响,提示它们在DNA超螺旋水平的调节过程中发挥相反的作用,并进而参与全局性的转录调控.

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中国科学院生物物理研究所和中国生物物理学会共同主办
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文章信息

陈媛媛, 张先恩, 毕利军
CHEN Yuan-Yuan, ZHANG Xian-En, BI Li-Jun
耻垢分枝杆菌宿主整合因子(IHF)对DNA拓扑结构的影响
Effects of Integration Host Factor (IHF) From Mycobacterium smegmatis on DNA Topological Structure
生物化学与生物物理进展, 2017, 44(12): 1110-1117
Progress in Biochemistry and Biophysics, 2017, 44(12): 1110-1117
http://dx.doi.org/10.16476/j.pibb.2017.0271

文章历史

收稿日期: 2017-07-11
接受日期: 2017-10-13

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