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分析超速离心技术研究膜蛋白TmrAB
褚文丹1,2 , 徐扬1,2 , 周翠燕1,2 , 芦亚菲1,2 , 于晓霞3 , 张瑞轩2 , 李文奇1,2     
1. 清华大学生命科学与医学研究院,蛋白质研究技术中心,北京 100084;
2. 清华大学生命科学学院,北京 100084;
3. 中国科学院生物物理研究所,北京 100101
摘要: 去垢剂在膜蛋白的提取纯化过程中起到必要的作用,对膜蛋白的聚合状态、结晶条件以及理化性质等方面都有较大影响.分析超速离心技术(analytical ultracentrifuge,AUC)通过测定溶液中膜蛋白-去垢剂复合物在离心场中的沉降运动轨迹,可以分析获得其沉降系数、摩尔质量、流体力学半径、结合常数等水力学和热力学性质,进而判断膜蛋白-去垢剂复合物的均一性及聚合状态.本文以嗜热菌来源的ATP结合转运蛋白(ABC transporter)TmrAB作为研究对象,利用分析超速离心技术结合分子排阻层析和冷冻电镜负染技术,研究其均一性、聚合状态以及去垢剂与膜蛋白的摩尔比.结果显示,在8倍临界胶束浓度(critical micelle concentration,CMC)的DDM条件下,TmrAB性质均一,并以异二聚体的单体形式存在,DDM与TmrAB的摩尔比为116:1.本研究表明,分析超速离心技术是一种测定膜蛋白分子质量、研究膜蛋白聚合状态的可靠手段.
关键词: 分析超速离心     分子排阻层析     冷冻电镜     膜蛋白     分子质量    
Study of Membrane Protein TmrAB by Analytical Ultracentrifugation
CHU Wen-Dan1,2 , XU Yang1,2 , ZHOU Cui-Yan1,2 , LU Ya-Fei1,2 , YU Xiao-Xia3 , ZHANG Rui-Xuan2 , LI Wen-Qi1,2     
1. School of Biomedicine in Tsinghua University, National Protein Science Facility, Beijing 100084;
2. School of Life Science, Tsinghua University, Beijing 100084;
3. Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101
*This work was supported by grants from China Postdoctoral Science Foundation (2014M550050), Advanced Innovation Center for Structural Biology
** Corresponding author: LI Wen-Qi1, Tel: 010-62782031, E-mail: liwenqi@tsinghua.edu.cn
Received: July 8, 2018 Accepted: September 5, 2018
Abstract: Detergent is critical for membrane protein purification, impacting the state of oligomerization, crystallization conditions and other physicochemical properties. Analytical ultracentrifugation (AUC), by characterizing the sedimentation of membrane protein-detergent complex in centrifugal fields, is able to measure various hydrodynamic and thermodynamic properties, including sedimentation coefficient, molar mass, hydrodynamic radius, binding coefficient, thus defining the homogeneity and oligomerization state of membrane protein-detergent complex. This study focuses on an ABC transporter from thermophilic bacteria, TmrAB, and utilizes AUC coupled to size-exclusion chromatography and negative staining electron microscopy to determine its homogeneity, oligomerization, and stoichiometry of membrane protein and detergent molecules. The results indicate that TmrAB complex exists as homogeneous monomer of heterodimers of TmrA and TmrB, in the condition of 8× Critical Micelle Concentration (CMC) DDM, having a ratio of DDM/TmrAB equal to 116:1. This study suggests, AUC is a reliable method to analyze the molecular mass of membrane protein.
Key words: analytical ultracentrifugation     membrane protein     size exclusion chromatography     Cryo-SEM     protein molecular mass    

膜蛋白是一类存在于生物膜内或与生物膜相互作用的蛋白质,包括锚定在生物膜内成为生物膜一部分的膜内在蛋白质,以及临时附着在磷脂双分子层上或内在膜蛋白上的外周膜蛋白.内在膜蛋白镶嵌在质膜结构内且在水溶液中不稳定,在表达纯化过程中需要加入适当种类和浓度的去垢剂,与内在膜蛋白以一定比例结合形成膜蛋白-去垢剂复合物,才能稳定存在于水溶液中[1].药物转运蛋白是一种内在膜蛋白,广泛存在于生物界细胞膜当中,能够结合、水解ATP释放能量,将膜内外的溶质如脂质、糖类、离子、氨基酸、多肽类、蛋白质以及有毒化合物等进行逆浓度梯度跨膜转运,参与到诸如介导抗药性等很多重要的生命活动当中[2].TmrAB是一种药物转运蛋白[3-4],结构生物学研究表明,TmrAB由含跨膜结构域(transmembrane domain,TMDs,主要形成跨膜通道)和核苷酸结合结构域(nuclietide-binding domain,NBDs)的单体蛋白质TmrA(64.6 ku)和TmrB(67.9 ku)形成异质二聚体[5-7].目前,还没有关于TmrAB溶液中聚集状态研究的相关报道.分析超速离心(AUC)技术是研究溶液中蛋白质分子质量、聚合状态的生物物理学方法,我们拟采用AUC技术对膜蛋白TmrAB进行其溶液状态下的聚合状态研究.

AUC沉降速率法结合大分子的沉降轨迹和热力学定律可以对膜蛋白的性质进行研究[8-9],通过紫外光与干涉光同时检测,分别解析数据,更全面和准确地了解蛋白质溶液的均一性、蛋白质的分子质量、聚合状态、去垢剂与膜蛋白的摩尔比等信息[10-12].分子排阻层析(SEC)技术可以通过与标准蛋白质分子质量标准曲线进行对比,依据洗脱体积对膜蛋白TmrAB的分子质量进行拟合计算,从另一种角度了解膜蛋白的溶液性质.电镜负染技术可以比较直观地对蛋白质样品进行观察,大致了解膜蛋白溶液的均一性[13].

本文首先利用原核表达系统,融合表达并分离纯化带有His标签的药物转运蛋白TmrAB,然后利用电镜负染技术、分子排阻层析技术以及分析超速离心技术综合分析膜蛋白TmrAB的性质,通过电镜观察得到在去垢剂DDM浓度为0.08%(8倍CMC)的条件下TmrAB的状态更为均一.然后分别运用分子排阻层析和分析超速离心技术测定膜蛋白TmrAB在去垢剂浓度为0.08%条件下的分子质量和聚合状态.实验发现,通过分子排阻层析计算得到的分子质量与蛋白质的理论分子质量相差较大,无法判断聚合状态,而利用分析超速离心技术可以分析得到膜蛋白的分子质量、膜蛋白-去垢剂复合物的分子质量、去垢剂与膜蛋白的摩尔比,进而判断膜蛋白TmrAB的聚合状态,得到了与文献报道一致的分析结果.说明分析超速离心技术是一种测定膜蛋白分子质量、研究膜蛋白聚合状态的可靠手段,可以得到关于膜蛋白的更准确、更全面的信息.

1 材料与方法 1.1 菌株与质粒

TmrAB质粒由清华大学王廷亮副教授惠赠,大肠杆菌感受态细胞DH5α和BL21(DE3)由本实验室制备.

1.2 酶与生化试剂

质粒小提试剂盒购自天根生物科技有限公司;去垢剂DDM购自ANATRACE公司;Bradford染料购自伯乐公司;蛋白质分子质量标准为本实验室自行制备;储液配制所需化学试剂购自国药集团化学试剂有限公司;Ni-NTA镍柱柱材购自Qiagen公司;Superdex 200层析柱购自GE公司.

1.3 蛋白质表达与纯化

将含有目的基因的菌种接种至100 ml氨苄抗性LB培养基中,37℃,220 r/min过夜培养,以1:100的比例将菌液转接至1L氨苄抗性LB培养基中,培养3~4 h至A600为1.3~1.5,加入0.5 mmol/L IPTG,20℃,220 r/min,过夜诱导. 4 000 r/min离心10 min收集菌体后超声破碎,将破碎后的菌液14 000 r/min离心10 min除去细胞碎片,上清即为粗膜溶液.将粗膜溶液于4℃条件下41 000 r/min,超速离心1 h,得到膜沉淀,用适量裂解缓冲液重悬转移至新离心管中,利用匀浆机将沉淀充分匀浆,得到的均匀膜溶液,加入1%DDM,4℃旋转孵育抽提2 h.抽提液在65℃水浴中加热30 min后冷却,4℃,41 000 r/min,超速离心30 min.取上清与Ni-NTA充分结合,用10 mmol/L咪唑,25 mmol/L Tris,pH 8.0,150 mmol/L NaCl,0.02% DDM或0.08% DDM淋洗液去除非特异性结合的杂蛋白质;再用250 mmol/L咪唑,25 mmol/L Tris,pH 8.0,150 mmol/L NaCl,0.02% DDM或0.08%DDM洗脱液对目的蛋白质进行洗脱.Bradford法检测蛋白质浓度,SDS-PAGE检测蛋白质大小与纯度.使用Centricon超滤管浓缩至2 ml左右,用Superdex-200色谱柱将目的蛋白质进一步纯化,结合紫外吸收峰位置及SDS-PAGE结果得到最终纯化的目的蛋白质备用[14].

1.4 Bradford法蛋白质定量

将考马斯亮蓝G-250储液稀释至原体积的5倍,摇匀备用.移取1 ml稀释液于1.5 ml离心管中,根据蛋白质溶液的浓度加入1~20 μl蛋白质溶液并混合均匀.室温静置1 min后,以考马斯亮蓝G-250稀释液为参比,在595 nm记录吸光度数值.最后通过公式计算蛋白质溶液的浓度,重复测定5次,取平均值即为蛋白质实际浓度,计算公式如下:

蛋白质浓度/(g·L-1)=25×A595 /(V/μl)

1.5 电镜负染分析

将纯化后的蛋白质定量至1.0 g/L,分别稀释5倍、10倍、20倍、30倍和40倍备用.将300目铜网和碳膜支撑膜放入等离子体清洗仪中进行表面亲水化处理,从而使蛋白质更容易与碳膜结合,然后将15 μl不同浓度的蛋白质样品滴至膜上,停留1 min后吸走残余液,小心滴入1%醋酸铀染液,与蛋白质结合10 s后吸干,重复染色3次,干燥后即完成制样.将制备好的负染样品装入电镜样品架,调整电镜状态后寻找样品位置,选择负染效果最好的部分进行观察.

1.6 分子排阻层析分析

将Superdex 200层析柱用pH 8.0,25 mmol/L Tris,150 mmol/L NaCl缓冲液平衡,分别将6 ku、43 ku、75 ku、158 ku的标准蛋白以500 μl的体积上样,设定流速0.5 ml/min,限压1.2 MPa,记录洗脱体积,以蛋白质分子质量对数为横坐标,分配系数Kav为纵坐标,建立标准曲线(Kav=(Ve-V0)/(Vt-V0),凝胶总体积Vt、外水体积V0、洗脱体积Ve).将Superdex-200层析柱用pH 8.0,25 mmol/L Tris,150 mmol/L NaCl,0.08% DDM缓冲液平衡.将分离纯化得到的目的蛋白用Bradford法定量至1.0 g/L,上样500 μl,以相同的实验程序进行分子排阻层析分析,记录目的蛋白质洗脱体积,收集紫外吸收峰位置样品,0.5 ml/管,对收集的样品进行SDS-PAGE分析.

1.7 分析超速离心分析

AUC技术可以利用分析超速离心机检测样品在溶液中的运动轨迹,分析样品的水力学参数、分子质量等性质.AUC-沉降速率实验选择的转速较高,是在一个较大的离心力作用下使样品在较短时间内全部沉降到样品池底部,并在不同时间收集的数据反映该时刻在不同径向位置的溶质浓度,然后利用Lamm方程和Svedberg方程得到沉降系数、扩散系数以及分子质量等信息[10].本实验采用美国Beckman公司的分析超速离心机ProteomeLab XL-I,调整样品浓度至A280 = 0.7,参比缓冲液成分为pH 8.0,25 mmol/L Tris,150 mmol/L NaCl.使用2孔铝合金离心池和蓝宝石窗口组成的样品池,将样品及参比液分别上样396 μl和400 μl,选择An-50 Ti的8孔转子在20℃,45 000 r/min的条件下进行沉降速率(SV)实验,同时选择紫外波长280 nm和干涉光两种检测方式,每6min采集一次数据,待样品全部离心至样品池底部时停止扫描,收集数据.运用SEDFIT (14.4f版)软件分析数据,分别处理紫外扫描结果和干涉光扫描结果,再通过GUSSI软件分析计算[15].利用紫外光进行检测,可以分析膜蛋白的信号;利用干涉光进行检测,可以分析膜蛋白-去垢剂复合物的信号;综合分析紫外和干涉光检测的数据可以得到去垢剂与膜蛋白的摩尔比、复合物微分比容、复合物分子质量等信息.

2 结果 2.1 蛋白质的表达与纯化

将构建好的质粒pQlink-TmrAB转化至大肠杆菌DH5α扩增,小量提取质粒后测序,比对结果无误.将上述表达质粒转化至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3),经过诱导表达、DDM抽提、超速离心、亲和层析和分子筛纯化,得到高纯度的膜蛋白TmrAB.聚丙烯酰氨凝胶电泳显示蛋白质纯度大于95%(图 1),适合进行下一步实验.

Fig. 1 Analysis of the purified proteins by SDS-PAGE The purified proteins were subjected to 15% SDS-PAGE.Lane 1: Protein marker; Lane 2: The purified membrane protein TmrAB.SDS-PAGE result shows that the membrane protein TmrAB purity is over 95%.
2.2 电镜观察结果

将纯化后的膜蛋白TmrAB按照电镜负染的处理方法,对去垢剂DDM浓度分别为0.02%和0.08%的膜蛋白质样品进行电镜观察,本实验最终选择0.05 g/L的蛋白质样品浓度,电镜放大倍数为49 000倍,得到结果如图 2所示.电镜观察结果显示膜蛋白TmrAB与去垢剂形成的复合物在去垢剂DDM浓度为0.08%条件下更为均一,因此我们选择去垢剂DDM浓度为0.08%的条件,对膜蛋白TmrAB进行下一步分析.

Fig. 2 Analysis of membrane protein TmrAB by Cryo-SEM The result of Cryo-SEM showed that the complex formed by the detergent and protein molecules was more homogeneous in the buffer containing 0.08% DDM than in the buffer containing 0.02%DDM. (a) The analysis of membrane protein TmrAB in 0.02%DDM by SEM. (b) The analysis of membrane protein TmrAB in 0.08% DDM by SEM.
2.3 分子排阻层析结果

通过标准蛋白质样品的分子排阻层析分析得到计算蛋白质分子质量的标准曲线(图 3a).将经过亲和柱、分子筛纯化得到的处于DDM终浓度为0.08%的膜蛋白TmrAB,体积定量为0.5 ml并上样至Superdex-200层析柱进行分子排阻层析分析,通过SDS-PAGE检测.在去垢剂DDM浓度为0.08%的缓冲液中,膜蛋白TmrAB均一性均较好,目的蛋白质出峰位置在11.6 ml(图 3b),通过标准蛋白质分子质量标准建立的标准曲线计算得到目的蛋白质分子质量为298.03 ku,与其理论分子质量132.5 ku相差较大,并且由于检测到的目的蛋白是膜蛋白TmrAB与去垢剂DDM形成的复合物,更加无法判断蛋白质的聚合状态.

Fig. 3 Analysis of membrane protein TmrAB by SEC The membrane protein TmrAB was analyzed by size exclusion chromatography (SEC), and the elution volume was 11.6 ml. According to the standard curve, the molecular mass of the protein was 298.03 ku, significantly larger than the theoretical molecular mass 132.5 ku. (a) Standard proteins on Superdex 200. (b) The analysis of membrane protein TmrAB in 0.08%DDM by SEC and SDS-PAGE.
2.4 分析超速离心结果

为了进一步分析膜蛋白TmrAB在0.08% DDM缓冲液中的分子质量和聚合状态,本文采用美国Beckman公司的分析超速离心机ProteomeLab XL-I在45 000 r/min条件下对样品进行沉降速率(SV)实验,测得样品A280=0.8,IF=4.5.离心4 h后将样品的35个紫外扫描数据和干涉光扫描数据分别导入Setfit软件进行分析.选定边界和处理范围,以空气与样品的界面为meniscus,以7.15 mm处为bottom,采用c(s)模型,设定实验参数进行计算和拟合,得到紫外拟合结果RMSD在0.006左右,干涉光拟合结果RMSD在0.01左右,说明结果真实可靠.

经过Setfit软件处理后,运用GUSSI软件进一步分析膜蛋白TmrAB的分子质量信息、聚合状态以及膜蛋白-去垢剂复合物的组成.在GUSSI软件中,导入紫外和干涉光的数据分析结果,选择Fitted f/f0计算模式,依次填写实验参数,其中蛋白质的相关参数如消光系数(ε)、微分比容(ν)、理论分子质量(M)以及比折光指数增量(dn/dc)通过已知的蛋白序列在Setfit软件中获得,去垢剂DDM的相关参数查阅文献获得,f/f0为分析紫外光和干涉光检测得到的数据,分析得到膜蛋白TmrAB在DDM浓度为0.08%的条件下拟合分子质量为:150.2 ku,证明膜蛋白TmrAB是以异二聚体的单体形式存在,与文献报道一致[5].

经过SETFIT软件的c(s)模型分析发现,当去垢剂DDM浓度为0.08%时,膜蛋白TmrAB和去垢剂DDM的复合物沉降系数为8.25S(图 4a),而且峰宽较窄,说明在此条件下膜蛋白TmrAB聚合状态非常均一.通过GUSSI软件分析进一步得到:在DDM浓度为0.08%的条件下,去垢剂与蛋白质复合情况为0.396gDDM/gTmrAB,去垢剂DDM与膜蛋白TmrAB的摩尔比为116:1,复合物的分子质量为209.7 ku,和c(s)模型分析的结果相一致.GUSSI分析结果详见表 1.

Fig. 4 Analysis of membrane protein TmrAB by AUC The membrane protein TmrAB was analyzed by UV and interference light at the same time, the amount of the protein was determined by UV detection while the total amount of the complex was determined by interfering light.The properties of the protein, detergent and the molecular mass of the complex could be analyzed by GUSSI.(a) The analysis of membrane protein TmrAB in 0.08%DDM by Setfit. (b) The analysis of membrane protein TmrAB in 0.08%DDM by GUSSI.
Table 1 Molecular mass analysis of TmrAB by GUSSI
3 讨论

本文研究的药物转运蛋白TmrAB是一种典型的膜蛋白.膜蛋白质是生物体中一类非常重要的蛋白质,约占蛋白质组成的30%,几乎存在于所有生物体中.膜蛋白在生物体内具有广泛而且重要的生物学功能,有很多疾病以及治疗方法都与之相关,例如约有60%的药物靶点为膜受体和离子通道,同时一些膜蛋白质还对病原体的毒力与耐药性有重要影响.因此,膜蛋白质结构测定对于研究其作用与功能和以之为靶点的药物设计都有非常重要的生物学意义和临床意义[16].

本文首先通过直观的电镜负染分析得到,膜蛋白TmrAB在去垢剂DDM浓度为0.08%(8倍CMC)的溶液中均一性明显优于2倍CMC;通过分子排阻层析方法分析膜蛋白TmrAB得到复合物表观分子质量为298.03 ku,无法确定聚合状态;通过分析超速离心技术分析得到膜蛋白-去垢剂复合物的拟合分子质量为194.3 ku、去垢剂DDM与膜蛋白TmrAB的摩尔比为116:1,蛋白质拟合分子质量为150.2 ku,是以TmrA和TmrB结合形成的异质二聚体的单体形式存在.综合分析实验结果我们认识到,分子排阻层析方法测定膜蛋白质分子质量和判断聚合状态具有一定的局限性,一方面是由于去垢剂与蛋白质的结合具有一定的比例,复合物的理论分子质量难以计算,另一方面是由于膜蛋白质分子与去垢剂结合后的形状会影响其在分子排阻层析上的洗脱位置,导致计算得到的分子质量与实际分子质量有很大出入.分析超速离心技术却可以从以下两方面解决膜蛋白分子质量和聚合状态的测定问题:首先,分析超速离心技术-沉降速率法对于分子质量的测定是根据粒子的沉降过程,利用Svedberg方程和Lamm方程进行计算得到的绝对分子质量,不需要标准蛋白质校正;其次,在进行膜蛋白分子质量的测定时,分析超速离心技术可以同时检测紫外光信号和干涉光信号,分析得到去垢剂和膜蛋白的摩尔比,计算膜蛋白以及复合物的分子质量,进而判断膜蛋白的聚合状态,且分析超速离心技术实验方法更为简便快捷.

实验中我们发现,TmrAB的溶液均一性在DDM浓度为0.08%(8倍CMC)条件下明显优于DDM浓度为0.02%(2倍CMC).而在膜蛋白的提取纯化、结晶条件筛选以及理化性质研究中,一般选择去垢剂浓度为2倍CMC,在此条件下,去垢剂不一定能与膜蛋白形成稳定均一的复合物.通过本研究我们认为,去垢剂的浓度对膜蛋白-去垢剂复合物的形成存在较大的影响,在分析膜蛋白的性质时,应充分考虑去垢剂浓度的影响.

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中国科学院生物物理研究所和中国生物物理学会共同主办
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褚文丹, 徐扬, 周翠燕, 芦亚菲, 于晓霞, 张瑞轩, 李文奇
CHU Wen-Dan, XU Yang, ZHOU Cui-Yan, LU Ya-Fei, YU Xiao-Xia, ZHANG Rui-Xuan, LI Wen-Qi
分析超速离心技术研究膜蛋白TmrAB
Study of Membrane Protein TmrAB by Analytical Ultracentrifugation
生物化学与生物物理进展, 2018, 45(10): 1047-1053
Progress in Biochemistry and Biophysics, 2018, 45(10): 1047-1053
http://dx.doi.org/10.16476/j.pibb.2018.0200

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收稿日期: 2018-07-08
接受日期: 2018-09-05

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