2. 邵阳学院附属医院病理科, 邵阳 422000;
3. 南华大学附属第一医院, 衡阳 421001;
4. 南华大学医学院临床医学卓越医师班本科生, 衡阳 421001
2. Department of Pathology, Affiliated Hospital of Shaoyang University, Hunan Shaoyang 422000, China;
3. The First Affiliated Hospital of University of South China, Hengyang 421001, China;
4. Clinical Medicine Excellent Undergraduate of Medical College, University of Southern China, Hengyang 421001, China
胃癌是中国最常见的恶性肿瘤之一, 其发病率与死亡率均居所有消化道恶性肿瘤之首[1-2].大量的研究表明, 胃癌的发生发展与基因的异常表达有关, 涉及癌基因激活与抑癌基因失活[3-4].目前, 胃癌发病的分子机制尚不清楚.许多研究证实, 微RNA(microRNA, miRNA)表达与胃癌的发生发展密切相关[5-6].miRNA通过调控基因的表达, 参与肿瘤细胞增殖、侵袭与转移等过程[7-8].本研究选取miR-125b进行深入研究, 观察其表达对胃癌MGC-803细胞增殖的影响及相关分子机制, 为进一步阐明胃癌发病的分子机制提供理论依据.
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞系胃腺癌MGC-803细胞购自美国ATCC, 用含10%胎牛血清、1%青霉素、链霉素的RPMI-1640培养液, 置于37℃含5% CO2培养箱中常规培养.
1.1.2 组织标本收集126例南华大学附属第一医院胃腺癌手术切除标本(2012年1月至2014年12月), 配对取原发胃癌组织及癌旁10 cm以上黏膜组织(正常胃黏膜).其中患者年龄≥60岁者53例, < 60岁者73例;男性70例, 女性56例;高、中分化腺癌32例, 低分化或未分化腺癌94例;肿块≥3cm者71例, < 3 cm者55例;TNM分期Ⅰ-Ⅱ期者51例, Ⅲ-Ⅳ期者75例;无淋巴结转移者38例, 有淋巴结转移者88例.后续实验中随机选择36例胃癌患者进行miRNA表达检测.
1.1.3 主要试剂与仪器miR-125b模拟物(miR-125b mimics)、miRNA- qPCR定量试剂盒购自GeneCopoeia公司, AMV逆转录试剂盒、Dual-Luciferase Reporter Assay System、β半乳糖苷酶活性检测试剂盒购自Promega公司, miR-125原位杂交探针购自Exiqon公司, Trizol、lipofectamine2000购自Invitrogen公司, 一抗与二抗购自Santa Cruz公司, Real-Time PCR仪为Bio-Rad公司产品.
1.1.4 引物序列采用在线软件miRBase(http://www.mirbase.org/)分析miR-125 mimics序列.在线软件TargetScan 6.2(http://www.targetscan.org/), 分析miR-125b预测MCL1基因3′UTR序列结合位点, 根据pMIR-REPORTTM miRNA表达报告载体的酶切位点, 设计引物序列, 另外在结合位点处设计突变位点, 采用Premier 5在线软件设计引物序列.MCL1基因引物序列:Forward primer, 5′ TAAGG-ACAAAACGGGACTGG 3′, Reverse primer, 5′ CCTCTTGCCACTTGCTTTTC 3′;β-Actin基因引物序列:Forward primer, 5′ GGGCACGAAGG-CTCATCATT 3′, Reverse primer, 5′ AGCGAG-CATCCCCCAAAGTT 3′.由南京金斯瑞公司合成.
1.2 方法 1.2.1 生物信息学分析选用在线生物信息学软件Targetscan 6.2(http://www.targetscan.org/)进行miRNA靶点预测, 分析micRNA与靶基因3′UTR序列片段结合位点.
1.2.2 qRT-PCR检测收集细胞与组织, 分别加入Trizol溶解, 根据Trizol试剂操作程序, 抽提总RNA, 检测RNA的浓度、纯度和质量, 按照AMV逆转录试剂盒操作步骤, 进行逆转录.PCR扩增设20 μl体系: 2×SYBR Mix 10 μl、miR-125b或U6逆转录产物2.0 μl、Taq DNA聚合酶(5 U/μl) 0.2 μl、miR- 125b或U6特异性引物(5 μmol/L) 0.4 μl、无酶水7.4 μl.反应条件为:95.0℃, 3 min变性;95.0℃, 12 s;62.0℃, 35 s, 40个循环;熔解曲线检测从62.0℃开始至95.0℃停止, 计算不同组的CT值, 用ΔCT评价miRNA的表达.实验重复检测3次.
1.2.3 原位杂交将收集的组织制作石蜡切片, 常规脱蜡, 滴加3% H2O2灭活内源性辣根过氧化物酶.洗片后, 滴加3%胃蛋白酶暴露mRNA片段.洗片后, 滴加预杂交液, 擦干切片滴加杂交液(miRNA探针:杂交液= 1:250), 杂交过夜, SSC洗涤, 滴加生物素化鼠抗地高辛于组织, PBST洗涤, DAB显色, 苏木素染色, 脱水、透明、干燥后封片, 显微镜观察.依据组织染色程度(阴性、1~4分)及阳性细胞数(0~25%:1分;26%~50%:2分;51%~75%:3分;76%~100%:4分)计分, 将两者计分相乘, ≥8分者为高表达, < 8分者为低表达.
1.2.4 miRNA或siRNA转染将细胞接种于6孔板中, 根据lipofectamine2000操作说明书, 配制相应浓度miRNA或siRNA;将lipofectamine2000分别与miRNA或siRNA混匀, 放置30 min, PBS与无血清培养基洗涤待转细胞;将miRNA或siRNA与lipofectamine2000混合液滴加到待转染细胞中;37℃、5% CO2培养箱中放置4~6 h, 加入含10%胎牛血清培养基;扩大培养, 进行后续检测.
1.2.5 蛋白质印迹检测收集细胞与组织, 分别提取总蛋白质, 测定蛋白质浓度, 以每孔50 μg蛋白质, 经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离, 将分离蛋白质转移到PVDF膜, 脱脂牛奶封闭, 一抗(1:1 000) 4℃孵育过夜, 洗膜后二抗(1:2 000)常温孵育1 h, 洗膜、曝光、显影、定影, 成像系统拍照.扫描胶片蛋白质条带, 采用Image Quant软件进行蛋白质条带灰度值分析, 计算蛋白质表达灰度值(V值), 蛋白质灰度值(Vx)与内对照灰度值(Vβ-actin)比值为蛋白质相对表达强度(Rx=Vx/Vβ-actin), 即蛋白质的相对表达量.实验重复检测3次.
1.2.6 MTT检测将miR-125b mimics或无关序列转染细胞后, 用含10%胎牛血清培养基培养细胞.按照5 000个/孔细胞接种至96孔板, 继续培养48 h;每孔加入20 μl MTT(5 g/L)溶液, 培养4 h, 吸去溶液, 每孔加入150 μl DMSO溶解, 将培养板置于酶标仪(490 nm波长)中测定每孔的吸光度值, 分析细胞的增殖情况.实验重复检测3次.
1.2.7 流式细胞仪(FCM)检测对数生长期细胞, 无血清RPMI 1640培养细胞24 h, 收集2×106个细胞, 用PBS洗涤细胞, 加入4℃ 70%乙醇固定细胞2 h.吸取1 ml细胞悬液, PBS洗涤细胞, 加入20 mg/L RNA酶, Tris-HCl缓冲液, 37℃孵育30 min, 加入50 mg/L碘化丙锭染色, 通过流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡情况.实验重复检测3次.
1.2.8 pMIR-REPORTTM/MCL1荧光素酶报告载体构建通过在线软件TargetScan 6.0分析miRNA- 125b与MCL1基因结合位点.结合位点前、后延长约60 bp, 片段两端加入酶切位点, 同时设计miRNA-125b结合位点突变序列, 合成相应序列片段.将寡核酸片段稀释, 退火(条件:94℃ 5 min, 50℃ 10 min)使反义链与正义链片段相结合, 获得双链寡核酸片段;酶切双链寡核酸片段与pMIR-REPORTTM Luciferase质粒, 1%琼脂糖凝胶电泳, 回收、纯化、连接, 获得pMIR-REPORTTM/ MCL1荧光素酶报告载体.
1.2.9 荧光报告素酶活性分析取对数生长期细胞, 接种细胞于12孔板中, 采用脂质体进行共转染miRNA、pMIR-report载体及对照0.5 μg β半乳糖苷酶表达质粒, 转染48 h后, 参考荧光素酶活性检测试剂盒说明书操作, 通过单光子检测仪测定荧光素酶活.根据β半乳糖苷酶活性检测试剂盒说明书操作, 检测各孔β半乳糖苷酶活性, 计算相对荧光素酶活性=荧光素酶活性值/β半乳糖苷酶活性, 为检测孔中的荧光素酶活性.实验重复检测3次.
1.2.10 统计学处理采用SPSS18.0软件进行数据分析, 数据用均数±标准差(mean±SD)表示, 两组均数比较采用t检验, 多样本均数比较采用单因素方差分析, 组间两两比较采用q检验, 3组及以上比较采用单因素方差分析(one way ANOVA), 不同组织间蛋白质表达比较采用成组T-test法, 组间相关性采用Spearman等级相关进行比较, 组织间蛋白质表达与临床资料的关系采用方差分析和χ2检验分析, 以P < 0.05表示差异有统计学意义.
2 结果 2.1 miR-125b在胃癌组织中的表达及意义采用qRT-PCR检测了36例胃癌及配对正常胃黏膜组织中miR-125b的表达.结果显示, miR-125b在胃癌组织中表达低于正常胃黏膜组织(图 1a, P < 0.05).另外, 采用原位杂交检测了126例(含qRT-PCR检测36例胃癌)胃癌及正常胃黏膜组织中miR-125b的表达.结果显示:miR-125b在胃癌组织中表达低于正常胃黏膜组织(图 1b), 其在胃癌组织中与癌组织分化程度呈正相关(表 1, P < 0.05);miR-125b在Ⅰ-Ⅱ期患者阳性表达率高于Ⅲ-Ⅳ期患者, 与TNM分期呈负相关(表 1, P < 0.05);miR-125b在淋巴结转移患者中的阳性表达较无淋巴结转移者低, 与淋巴结转移呈负相关(表 1, P < 0.05).结果提示, miR-125b与胃癌的分化程度、TNM分期及淋巴结转移密切相关.
(a) Expression of miR-125b detected by qRT-PCR in gastric cancer tissue, versus normal gastric mucosa, *P < 0.05. (b) Expression of miR-125b detected by in situ hybridization in gastric cancer tissue(×20). (c) A: Normal gastric mucosa. B: High differentiated adenocarcinoma. C: Middle differentiated adenocarcinoma. D: Low differentiated adenocarcinoma. |
根据原位杂交检测结果, 将126例胃癌患者分为miR-125b高、低表达两组, 比较miR-125b表达与患者预后的关系.结果显示, miR-125b高表达组患者平均生存时间(28.0±11.6)个月, 而miR-125b低表达组患者平均生存时间(22.1±11.9)个月.Kaplan-meier生存曲线分析结果显示, miR-125b低表达组患者生存率(overall survival, OS)低于miR-125b高表达组(图 2a, P=0.002).miR-125b高表达组患者平均无病生存时间(23.2±14.1)个月, miR-125b低表达组患者平均无病生存时间(12.8±16.8)个月.Kaplan-meier生存曲线分析结果显示, miR-125b高表达组患者无病生存率(disease free survival, DFS)高于miR-125b低表达组(图 2b, P=0.008).结果提示, miR-125b表达与胃癌患者预后呈正相关.
(a) The relationship between the expression of miR-125b in gastric cancer and the total survival rate of patients. P < 0.001. (b) The relationship between the expression of miR-125b in gastric cancer and the disease free survival rate of patients. P < 0.001. |
为了解miR-125b表达对MGC-803细胞的影响, 将miR-125b mimics和无关序列(对照)转染MGC-803细胞, 采用qRT-PCR检测了miR-125b在MGC-803细胞中的表达, 结果显示miR-125b mimics转染后MGC-803细胞中miR-125b表达增加(图 3a).将转染miR-125b mimics的MGC-803细胞, 接种于24孔板中, 24 h、48 h、72 h和96 h后细胞计数, 绘制细胞生长曲线, 结果显示, miR-125b高表达后MGC-803细胞增殖抑制(图 3b, P < 0.01).
(a) The expression of miR-125b detected by qRT-PCR in MGC-803 cells, versus miR-control, **P < 0.01. (b) The effect of miR-125b expression on the proliferation of MGC-803 cells observed by growth curve, versus miR-control, **P < 0.01. |
采用流式细胞仪检测miR-125b高表达对MGC-803细胞凋亡的影响.结果显示, miR-125b高表达后MGC-803细胞凋亡率增加(图 4a, P < 0.01), 提示miR-125b高表达可促进MGC-803细胞的凋亡.另外, 采用蛋白质印迹检测miR-125b高表达对caspase-3信号通路的影响.结果显示, miR-125b高表达后, 细胞中裂解caspase-3与裂解PARP表达增加(图 4b), 说明miR-125b高表达可能增加裂解caspase-3与裂解PARP, 活化caspase-3信号通路而抑制MGC-803细胞增殖.
(a) The effects of miR-125b expression on the apoptosis of MGC-803 cells detected by flow cytometry, versus miR-control, P < 0.01. (b) The effects of miR-125b expression on the cleaved caspase-3 and cleaved PARP proteins detected by Western-blot. |
通过在线Targetscan6.2软件预测了miR-125b靶基因, 发现miR-125b能与MCL1 3′UTR的2 613~2 620位核苷酸结合(图 5a).采用荧光素报告酶活性分析检测miR-125b表达对MCL1启动子活性的影响.结果表明, MCL1 3′UTR序列、MCL1 3′UTR突变序列与miR-125b mimics分别共转染MGC-803细胞, 野生型荧光素酶活性显著下降(图 5b, P < 0.05)而突变型荧光素酶活性无明显影响, 说明miR-125b可与MCL1 3′UTR结合.将miR-125b mimics转染MGC-803细胞, 采用qRT-PCR和蛋白质印迹检测MCL1的表达.结果显示, miR-125b高表达后, MGC-803细胞中MCL1 mRNA及蛋白质表达均降低(图 5c, P < 0.05), 说明miR-125b可抑制MCL1表达.
(a) The target binding of miR-125b and 3'UTR of MCL1 gene analyzed by Targetscan6.2. (b) The binding of miR-125b and 3'UTR of MCL1 gene analyzed by fluorescein reporter enzyme activity, versus miR-control, *P < 0.05. (c) The expression of MCL1 gene affected by miR-125b. A: The expression of MCL1 mRNA detected qRT-PCR, versus miR-control, *P < 0.05. B: The expression of MCL1 protein detected by Western-blot. |
si-MCL1与si-control(对照)分别转染MGC-803细胞后, 接种于24孔板中, 24 h、48 h、72 h和96 h后细胞计数, 绘制细胞生长曲线, 结果显示, 与si-control组比较, MCL1表达降低后MGC-803细胞的增殖抑制(图 6, P < 0.01).
**P < 0.01. |
采用流式细胞仪检测MCL1低表达对MGC-803细胞凋亡的影响.结果显示, MCL1低表达后MGC-803细胞的凋亡率增加(图 7a, P < 0.01).另外, 采用蛋白质印迹检测MCL1低表达对caspase-3信号通路的影响.结果显示, MCL1表达降低后, 裂解caspase-3与裂解PARP增加(图 7b), 说明MCL1表达降低后裂解caspase-3与裂解PARP表达增加, 活化caspase-3信号通路抑制MGC-803细胞增殖.
(a) The effects of low expression of MCL1 gene on the apoptosis of MGC-803 cells detected by flow cytometry, versus si-control, P < 0.01. (b) The effects of low expression of MCL1 gene on the cleaved caspase-3 and cleaved PARP proteins detected by Western-blot. |
胃癌是严重威胁中国人健康与生命的一种常见恶性肿瘤.胃癌的发生与癌基因、抑癌基因、DNA修复基因、细胞周期与凋亡调控基因及表观遗传学的变化等有关[1-4].癌基因激活对胃癌进展具有促进作用, 如癌基因PRL-3、K-ras、c-erbB2与c-met等[3, 9-10].抑癌基因失活同样在胃癌发病过程中发挥重要作用, 如抑癌基因p53、RUNX3[4, 11-12].
MicroRNAs(miRNAs)与特异性mRNA分子形成RNA诱导沉默复合物, 导致mRNA降解或阻碍mRNA翻译, 沉默靶基因表达[5-8].大量研究显示, miRNAs既可促进癌细胞的生长与增殖, 也可以抑制癌细胞的进展[5-8].miRNAs作为基因表达的调节者, 在细胞内参与肿瘤相关基因表达的调节, 影响与肿瘤发生发展[13].胃癌组织中miR-106a高表达, 且与胃癌大小、TNM分期及淋巴结转移密切相关[14].miR-133a通过抑制TAGLN2基因表达而发挥其抑瘤作用[15].miR-374a抑制SRCIN1基因表达, 诱导胃癌细胞增殖、侵袭与转移[16].本研究发现胃癌组织中miR-125b低表达.胃癌MGC-803细胞中miR-125b高表达后, 抑制细胞增殖.
为了解miR-125b调控细胞增殖的作用机制, 本研究利用Targetscan6.2分析了miR-125b对MCL1基因的靶向抑制, 发现miR-125b可与MCL1的3′UTR结合.MCL1基因属BCL-2基因家族成员之一, 参与细胞分化、细胞周期与凋亡的调控等[17].MCL1在多种恶性肿瘤中均高表达, 降低细胞中MCL1表达后促进癌细胞的凋亡, 抑制癌细胞增殖, 引起细胞周期阻滞[18].本研究显示, miR-125b高表达后MGC-803细胞增殖能力降低, 凋亡率增加, 裂解caspase-3与裂解PARP增加, MCL1的mRNA及蛋白质表达均降低, 另外, 干扰MCL1表达后, 同样细胞增殖能力降低, 凋亡率增加, 裂解caspase-3与裂解PARP增加.本研究证实miR-125b在胃癌组织中低表达, 与胃癌组织分化程度、TNM分期、淋巴结转移及患者预后相关.miR-125b通过抑制MCL1基因表达, 活化caspase-3信号通路, 抑制MGC-803细胞增殖.
总之, 本研究分析了miR-125b在胃癌组织中表达及与患者预后的关系, 观察了miR-125b高表达对细胞增殖及凋亡的影响, miR-125b通过抑制MCL1基因表达, 活化caspase-3信号通路, 抑制MGC-803细胞增殖.本研究为揭示miR-125b在胃癌的抑瘤功能与作用机制, 以及阐明胃癌的发病机制提供了一定的理论依据, 但是具体的机制有待进一步研究.
[1] | Chen W, Zheng R, Baade P D, et al. Cancer statistics in China, 2015. CA Cancer J Clin, 2016, 66(2): 115-132 DOI:10.3322/caac.21338 |
[2] |
黄琳, 张志伟, 肖娟, 等. POSTN蛋白在胃黏膜癌变过程中的表达及意义. 诊断病理学杂志, 2015, 22(9): 558-561
Huang L, Zhang Z W, Xiao J, et al. Chinese Journal of Diagnostic Pachnology, 2015, 22(9): 558-561 http://www.wanfangdata.com.cn/details/detail.do?_type=perio&id=zdblxzz201509014 |
[3] | Strand M S, Lockhart A C, Fields R C. Genetics of gastric cancer. Surg Clin North Am, 2017, 97(2): 345-370 DOI:10.1016/j.suc.2016.11.009 |
[4] | Katona B W, Rustgi A K. Gastric cancer genomics: advances and future directions. Cell Mol Gastroenterol Hepatol, 2017, 3(2): 211-217 DOI:10.1016/j.jcmgh.2017.01.003 |
[5] | Wang Q X, Zhu Y Q, Zhang H, et al. Altered miRNA expression in gastric cancer: a systematic review and meta-analysis. Cell Physiol Biochem, 2015, 35(3): 933-944 DOI:10.1159/000369750 |
[6] | Xu Q, Liu J W, Yuan Y. Comprehensive assessment of the association between miRNA polymorphisms and gastric cancer risk. Mutat Res Rev Mutat Res, 2015, 763(1-3): 148-160 |
[7] | Zhang Y, Wu Y Y, Jiang J N, et al. miRNA-3978 regulates peritoneal gastric cancer metastasis by targeting legumain. Oncotarget, 2016, 7(50): 83223-83230 |
[8] | Hu J, Shan Z, Hu K, et al. miRNA-223 inhibits epithelial- mesenchymal transition in gastric carcinoma cells via Sp1. Int J Oncol, 2016, 49(1): 325-335 DOI:10.3892/ijo.2016.3533 |
[9] | Xiong J, Li Z, Zhang Y, et al. PRL-3 promotes the peritoneal metastasis of gastric cancer through the PI3K/Akt signaling pathway by regulating PTEN. Oncol Rep, 2016, 36(4): 1819-1828 DOI:10.3892/or.2016.5030 |
[10] | Ahn S Y, Kim J, Kim M A, et al. Increased HGF expression induces resistance to c-MET tyrosine kinase inhibitors in gastric cancer. Anticancer Res, 2017, 37(3): 1127-1138 DOI:10.21873/anticanres |
[11] | Mori J, Tanikawa C, Ohnishi N, et al. EPSIN 3, a novel p53 target, regulates the apoptotic pathway and gastric carcinogenesis. Neoplasia, 2017, 19(3): 185-195 DOI:10.1016/j.neo.2016.12.010 |
[12] | Wang N, Sui F, Ma J, et al. Site-specific hypermethylation of RUNX3 predicts poor prognosis in gastric cancer. Arch Med Res, 2016, 47(4): 285-292 DOI:10.1016/j.arcmed.2016.07.011 |
[13] | Vasilatou D, Sioulas A D, Pappa V, et al. The role of miRNAs and epigenetic mechanisms in primary gastric mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma. Future Oncol, 2016, 12(13): 1587-1593 DOI:10.2217/fon-2016-0038 |
[14] | Hou X, Zhang M, Qiao H. Diagnostic significance of miR-106a in gastric cancer. Int J Clin Exp Pathol, 2015, 8(10): 13096-13101 |
[15] | Li AY, Yang Q, Yang K. miR-133a mediates the hypoxia-induced apoptosis by inhibiting TAGLN2 expression in cardiac myocytes. Mol Cell Biochem, 2015, 400(1-2): 173-181 DOI:10.1007/s11010-014-2273-2 |
[16] | Xu X, Wang W, Su N, et al. miR-374a promotes cell proliferation, migration and invasion by targeting SRCIN1 in gastric cancer. FEBS Lett, 2015, 589(3): 407-4013 DOI:10.1016/j.febslet.2014.12.027 |
[17] | Powell J A, Lewis A C, Zhu W, et al. Targeting sphingosine kinase 1 induces MCL1-dependent cell death in acute myeloid leukemia. Blood, 2017, 129(6): 771-782 DOI:10.1182/blood-2016-06-720433 |
[18] | Cui J, Placzek W J. PTBP1 modulation of MCL1 expression regulates cellular apoptosis induced by antitubulin chemotherapeutics. Cell Death Differ, 2016, 23(10): 1681-1690 DOI:10.1038/cdd.2016.60 |