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CRISPR家族新成员:CRISPR-Cpf1
周晨晨 , 刘写写 , 谢海华 , 谷峰     
温州医科大学眼视光学院 眼视光学和视觉科学国家重点实验室,温州 325027
摘要: 近年来,基因组编辑技术得到了飞速发展,该技术正在基础生物学研究、医学、生物技术等多个领域引起一场新的变革.Cpf1,作为CRISPR系统的新成员,极大地扩展了基因编辑靶位点的选择范围,同时其介导的多基因编辑具有明显的优势.另外,较短的crRNA序列也使Cpf1更容易产业化.本文将从Cpf1的结构和编辑特点、应用进展、目前面临的问题及展望等方面进行介绍和总结.
关键词: 基因组编辑技术     成簇规律间隔短回文重复(clustered regulatory interspaced short palindromic repeats,CRISPRs)     CRISPR-Cpf1    
The New Member of CRISPR Family, CRISPR-Cpf1
ZHOU Chen-Chen , LIU Xie-Xie , XIE Hai-Hua , GU Feng     
State Key Laboratory of Ophthalmology and Optometry, School of Ophthalmology and Optometry, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325027, China
*This work was supported by grants from The National Natural Science Foundation of China (81201181), Science and Technology Project of Zhejiang Province (2017C37176)
** Corresponding author: GU Feng, Tel: 0577-88831367, E-mail:gufenguw@gmaill.com
Received: April 27, 2018 Accepted: May 14, 2018
Abstract: In recent years, genome editing technology has been well developed, which have major implications for basic biology research, medicine, and biotechnology. As a new member of CRISPR system, Cpf1 greatly expands the choice of target sites for genome editing and has significant advantages in multiple gene editing. In addition, its shorter RNA sequences (crRNAs) make it closer for the application via industrial direct synthesis. Here we summarized the structure, gene editing characteristics, application progress, current limitations and future prospects of Cpf1 system.
Key words: genome editing technology     clustered regulatory interspaced short palindromic repeats (CRISPRs)     CRISPR-Cpf1    

基因组编辑技术是指在细胞基因组靶位点引入核酸序列变化的一类技术,包括碱基的插入、缺失、替换等,进而达到编辑基因的目的[1-2].为此,以锌指核酸酶(zinc-finger nucleases,ZFNs)、转录激活子样效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)和成簇规律间隔短回文重复(clustered regulatory interspaced short palindromic repeats,CRISPRs)系统为代表的基因组编辑工具应运而生,并在动植物和微生物基因组改造、表观遗传、疾病治疗等领域中得到广泛应用[3-4].其中,CRISPR-Cas系统是部分细菌和古细菌中的一种免疫防御系统,而CRISPR-Cas9基因组编辑工具自诞生以来因便捷的设计、高效的基因组编辑活性、较低的成本,成为生命科学领域最有前景的技术.随着CRISPR-Cas9系统不断被改进,对应序列的选择和保真性都得到不同程度提高,但是全基因组测序结果显示脱靶问题仍存在[5-7].这一特点的两面性体现为:在跟进病毒进化和加强防御功能方面,Cas9的脱靶现象优势明显(即能够识别并切割与靶DNA序列相似的位点);而在对人类疾病进行基因治疗时,脱靶问题则影响甚大,极大地限制了基因组编辑技术在人类中的应用[8].

2015年9月,张锋团队[9]为CRISPR家族增添一个新成员——Cpf1,属于CRISPR-Cas系统2类Ⅴ型.该系统不仅拥有较好的靶向切割DNA活性,同时还展现出显著区别于CRISPR-Cas9的编辑特点[9-15].国际上广泛使用的是氨基酸球菌属Cpf1(Acidaminococcus Cpf1,AsCpf1)和毛螺菌科Cpf1(Lachnospiraceae Cpf1,LbCpf1),但是由于它们识别5′-TTTN-3′的前间区序列邻近基序(protospacer adjacent motif,PAM)的灵活性不足,限制了其在基因编辑领域的应用[9, 16-21].笔者团队[22]则首次提出新凶手弗兰西斯菌来源的Cpf1(Francisella novicida Cpf1,FnCpf1)在人类细胞中存在颇为可观的切割效率,并系统测定了相关参数,确定PAM的序列扩展为5′-KYTV-3′(K指代T、G;Y指代C、T;V指代A、C、G).因此,Cpf1将作为“新型基因组编辑工具”与Cas9家族一起为科学研究和疾病治疗的开展提供更为广阔的发展空间[15, 21, 23-30].本文将从Cpf1的结构、作用原理和编辑特点、应用进展、目前面临的问题及展望等方面进行详细阐述.

1 Cpf1系统结构、作用原理和编辑特点 1.1 CRISPR-Cpf1系统结构和作用原理

研究表明,CRISPR-Cpf1不仅对DNA具有活性,而且对RNA同样有较高的活性[9, 22, 31-32].相比于最常用的CRISPR-SpCas9(Streptococcus pyogenes Cas9),Cpf1分子质量较小,仅约1 200~1 300个氨基酸[9].同时,其构成也与最常用的CRISPR-SpCas9不一样.区别在于Cpf1系统包括Cpf1蛋白和CRISPR RNA(crRNA),而不含有反式激活CRISPR RNA(trans activating CRISPR RNA,tracrRNA)序列,从而省去了tracrRNA催化CRISPR RNA前体(pre-crRNA)成熟的步骤[33-36].因此,CRISPR-Cpf1与CRISPR-Cas9系统在很多方面都有所不同(表 1,这里以最常用的CRISPR-SpCas9为代表进行比较).

Table 1 The comparison between Cpf1 and SpCas9 表 1 Cpf1和SpCas9的比较

Cpf1含有切割非靶向DNA链的RuvC核酸酶结构域,并以Nuc结构域代替了Cas9切割靶向DNA链的HNH核酸酶结构域[14, 34-35].研究人员指出,RuvC剪切非靶向DNA链是Nuc剪切靶向DNA链的先决条件.CRISPR-Cpf1系统是目前发现的最简单的细菌免疫系统.Cpf1可以对CRISPR DNA转录形成的pre-crRNA进行剪切,使之成熟为功能性的crRNA,随后Cpf1由crRNA引导,与特定PAM附近的DNA靶序列相结合,催化DNA双链断裂(double strand breaks,DSBs),(图 1,该图参考SpCas9和FnCpf1的结构图[14, 35]),激活细胞内的非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)或同源重组(homologous recombination,HR)修复机制,实现基因的敲除、插入、替换等编辑操作[14, 16, 21-22, 35, 37-38].

Fig. 1 Comparison of the stuctures and domains between SpCas9(a) and FnCpf1(b) 图 1 SpCas9(a)和FnCpf1 (b)结构组成和核酸酶结构域比较示意图 SpCas9和FnCpf1都含有切割非靶向DNA链的核酸酶结构域RuvC. (a) SpCas9切割靶向DNA链的核酸酶结构域为HNH, 成熟的crRNA由tracrRNA催化pre-crRNA形成. (b) FnCpf1切割靶向DNA链的核酸酶结构域为Nuc,成熟的crRNA由Cpf1蛋白直接催化pre-crRNA形成.

为了进一步探究Cpf1识别和剪切RNA以及DNA的作用原理,研究人员从相关的结构水平对其进行解析,并比较其与Cas9作用机制的异同.黄志伟团队[34]解析了LbCpf1-crRNA二元复合物的晶体结构,指出该复合物为二裂片结构,外观呈三角形,复合物中心有一带正电荷的通道.与sgRNA以伸展的构象和Cas9结合的方式不同,crRNA是一种高度扭曲的构象,一旦被Cpf1蛋白中部的寡聚核苷酸结合结构域(oligonucleotide binding domain,OBD)识别,即可诱导构象松散的Cpf1呈现紧凑的三角形结构.此时,蛋白质中心的正电荷通道能够接受crRNA和靶序列形成的异源双链,从而推进下一步反应.研究人员推测来自OBD的环状螺旋域(looped-out helical domain,LHD)结构域与识别双链DNA底物的PAM序列有关.多个团队在对AsCpf1-crRNA-DNA三元复合物晶体结构的解析中进一步发现,crRNA上游靠近PAM序列的“种子序列”(seed sequence)可能与Cpf1的脱靶相关[31, 35].在Cpf1结合靶DNA的过程中,种子序列经历了从无序到“A型”结构的构象变化.在该过程中,PAM互作结构域发生“开→关”的构象改变,以容纳有序的A型种子序列和靶DNA,并在正电荷通道内形成异源双链核酸分子.Montoya团队[14]则利用一种被称为X射线衍射晶体分析技术成功地可视化观察和描述了FnCpf1的工作方式,并确定了FnCpf1在对靶向DNA切割之后形成的三链R-loop(“R”型茎环)结构,这些结构的解析对理解FnCpf1精准地识别靶DNA序列的分子机制具有重要意义.

最近,相关研究人员发表了Cpf1系统进行有效基因组编辑的实验流程(protocol),并说明了如何能够设计工程化的CRISPR-Cpf1组件,包括引导核酸内切酶的crRNA和表达Cpf1蛋白的mRNAs,还描述了使用T7核酸内切酶Ⅰ(T7 endonuclease Ⅰ, T7EⅠ)和靶向深度测序去量化在人细胞系中的基因组编辑活性和脱靶效应[39].

1.2 CRISPR-Cpf1编辑特点

Cpf1与Cas9不同的作用机制和结构特点令其在进行基因编辑时不仅具有较好的切割活性和较高的特异性,更使得Cpf1在多基因编辑方面具有明显的优势.

1.2.1 CRISPR-Cpf1切割靶标DNA的位点

不同于Cas9利用RuvC和HNH结构域在种子区域进行平末端(blunt ends)切割,Cpf1使用RuvC和Nuc结构域在种子区域外靶DNA互补链的23位和非互补链的18位,产生交错切割的产物即产生黏性末端(sticky ends)[34].赵国屏团队[40]补充了Cpf1的切割特点,除了切割靶标DNA互补链的23位,Cpf1能在非互补链的14位到18位,形成多个切割位点.除此之外,该研究还发现Cpf1的切割位点受到间隔区(spacer)序列长度的影响.当spacer序列长度大于等于20的时候,除了切割靶标DNA互补链的23位外,Cpf1倾向于切割非互补链的18位,而当spacer序列长度小于20的时候,Cpf1倾向于切割非互补链的14位.这一特性便于新DNA序列的插入并且使得Cpf1能够更高效地激活HR[38].

1.2.2 CRISPR-Cpf1对PAM的选择范围

大多数Cas9蛋白偏好于富含G的PAM序列,而5′-NGG-3′的PAM对CRISPR-Cas的靶序列的选择产生了很大的限制.相比之下,16种Cpf1家族蛋白质均显示出对富含胸腺嘧啶的PAM选择性[9, 41-42],笔者团队[22]报道FnCpf1识别的PAM序列可扩展为5′-KYTV-3′,因此Cpf1的加入无疑扩展了基因组编辑的选择范围,有助于研究人员对富含嘧啶的PAM的靶位点进行编辑.最近David R. Liu团队[6]设计出一种称为xCas9的新酶进一步扩展了靶位点的可选区域,若能进行两者在活性和特异性上的平行比较实验,将极大丰富对Cpf1的全面认识.

1.2.3 CRISPR-Cpf1的特异性

Cpf1不仅具有良好的切割活性,还表现出高度的特异性.在体外实验中,Jin-Soo Kim团队[43]利用Digenome-seq技术,对经不同的基因编辑酶作用后的全基因组进行分析时得出结论:对于同一个crRNA,LbCpf1和AsCpf1分别有6个、12个脱靶位点,其数量远少于Cas9造成的脱靶(>90个).对crRNA的3′端4~6个碱基,Cpf1可以接受1~2个碱基与靶序列不匹配;对其余区域的碱基替换,则是零容忍.J. Keith Joung等[44]利用GUIDE-seq分析比较了AsCpf1和LbCpf1与SpCas9在体内的脱靶情况.Cpf1在绝大多数脱靶位点中,发生插入缺失(Indel)的频率低于0.1%.可以说,与SpCas9相比,Cpf1几乎没有脱靶,这对基因组编辑尤其是基因治疗是巨大的福音[21, 44-45].同样地,通过在人类全基因组范围内寻找潜在的脱靶位点并进行脱靶检测,笔者团队[22]发现FnCpfl在对人类基因组编辑的过程中有较高的保真性.

1.2.4 CRISPR-Cpf1多基因编辑

Cpf1丰富了CRISPR家族,独特的编辑特性也使Cpf1被认为是对目前的Cas9技术特别重要的补充.在基因组功能研究、遗传育种等过程中,通常需要多基因突变体,因此利用CRISPR技术进行多基因编辑显得十分重要.虽然也有利用Cas9进行多基因编辑的报道,如RNaseⅢ和Cas9共表达策略以及转运RNA(tRNA)和导向RNA结合的策略[46-48],但是这些策略无论是在设计还是成本方面仍然不方便或者不经济,大大限制了Cas9在多基因编辑方面的应用.而Cpf1弥补了Cas9在多基因编辑上的缺点.Cpf1只需要crRNA就可以完成基因组编辑,且Cpf1能够独立介导pre-crRNA加工而不需要其他分子的介入,并且加工RNA的能力独立于DNA剪切的功能[9].利用Cpf1这种独特的特性,张峰团队定制了CRISPR阵列,在HEK-293T细胞中实现了同时编辑DNMT1EMX1VEGFAGRIN2b等4个基因,在小鼠大脑中同时编辑DRD1MECP2NLGN33等3个基因[15].笔者团队利用FnCpf1在人类细胞中实现了多达5个基因的编辑(稿件已被接收).由于单个crRNA可靶向编辑多个基因,而且crRNA较短,在工业化合成方面具有明显的优势,这为Cpf1今后介导大规模基因组编辑奠定了基础.

2 CRISPR-Cpf1应用进展

尽管CRISPR/Cas9已经在遗传育种、基因治疗等领域得到了广泛应用,但是Cpf1诸多不同的基因编辑特点有望成为与Cas9功能互补的新型基因编辑工具.研究人员利用Cpf1在微生物、植物、哺乳动物方面做了大量探索.

2.1 Cpf1在微生物中的应用

谷氨酸棒杆菌是目前广泛应用的氨基酸生产菌株,其生产氨基酸的种类和数量由培养基中的碳氮比决定,但却很难通过基因工程来控制[49-50].杨晟团队[27]结合单链重组系统,利用FnCpf1建立了抗L-脯氨酸反馈抑制的高产菌株,菌株改造效率最高达到100%.利用该重组系统,研究人员将原先每轮一周的基因组编辑操作缩短到3天.同时,研究人员发现最为常用的SpCas9表现出对谷氨酸棒杆菌的毒性,而FnCpf1与谷氨酸棒杆菌适配.Himadri B. Pakrasi团队[51]在对蓝细菌的基因编辑研究中也发现了FnCpf1的毒性低.以往的相关实验显示,对蓝细菌的基因编辑主要依靠自发性的HR,机制单一、效率低下[52-55].而Himadri B.Pakrasi团队[51]利用FnCpf1对鱼腥藻等多种不同类型的蓝细菌基因组成功地进行了基因的敲除、插入和点突变.这为FnCpf1基因组编辑系统在未来工程菌的改造提供了很好的借鉴意义.

2.2 Cpf1在植物中的应用

为了证实Cpf1能够在植物中起到基因编辑的作用,Sang-Gyu Kim团队[56]以核糖核蛋白复合体(ribonucleoprotein complex,RNP)的形式利用AsCpf1和LbCpf1对大豆的FAD2基因和烟草的AOC基因进行编辑.Cpf1不仅产生更加丰富的缺失类型,还表现出更加精准的靶向特异性,即在各个潜在的脱靶位点都检测不到明显的脱靶现象.朱健康团队[57]在水稻的3个基因中选取了6个位点对FnCpf1和LbCpf1的活性进行比较,发现两种Cpf1都能在水稻中引起有效的突变,且LbCpf1的活性高于FnCpf1.该团队进一步针对OsRLKOsBEL基因分别设计了4个crRNA单元组成的crRNA矩阵序列,各位点的敲除效率均在40%~75%之间.王克剑团队[58]也利用Cpf1系统多基因编辑的优点成功对水稻进行了多基因的编辑.Cpf1系统在水稻中简单、高效地多基因定点编辑,拓展了CRISPR系统在植物中的应用,为水稻基因组定点编辑提供了一个新利器.

2.3 Cpf1在哺乳动物中的应用

在哺乳动物方面,Young Hoon Sung团队[59]分别利用电穿孔和显微注射的策略递送Cpf1至小鼠受精卵的细胞质中,最后成功在小鼠胚胎中实现7.7%的敲除效率,且在17个潜在脱靶位点处并没有发现脱靶现象.Eric N.Olson团队[15]首次报道了利用CRISPR-Cpf1在人类细胞和疾病模型小鼠中实现高效的基因修复.研究人员选择了杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy,DMD)小鼠模型及DMD患者来源的多能诱导干细胞(iPSCs)作为研究对象,将Cpf1 mRNA及靶向MDX基因的crRNA显微注射入小鼠受精卵,同时导入能够介导同源重组修复的单链DNA模板(ssDNA).结果显示,利用Cpf1介导的同源重组修复效率最高可达50%,突变基因被修复的小鼠均未出现肌肉萎缩症相关病症,且检测发现其均可正常表达mdx蛋白.J Keith Joung团队[60]则利用Cpf1系统具有多基因编辑的优点,将其改造成能同时转录激活多个靶位点的转录调节工具.相比于对照组,研究人员在转入Cpf1的U2OS细胞中观察到HBBNPY1R基因的高表达.

最近,赖良学团队[61]在线发表了应用Cpf1系统获得新的基因编辑研究成果,开创性地利用哺乳动物转运RNA(tRNA)内源剪切机制,对Cpf1系统的crRNA进行了改造,极大地提高了Cpf1在细胞系和动物胚胎中的基因编辑效率.在这项研究中,研究人员应用经改造的新型Cpf1基因编辑系统,对家兔的WRN基因进行了编辑,获得了世界首例家兔成年早衰模型,还通过Cpf1介导的体细胞基因编辑与细胞核移植技术,成功获得了经点突变PLN基因导致的扩张型心肌病猪模型以及DMD基因敲除形成的杜氏肌营养不良症猪模型,为研发相应疾病的治疗手段提供了理想的大动物模型.

2.4 基于CRISPR-Cpf1的新型检测工具

2018年2月,Jennifer A. Doudna团队[24]开发了基于Cpf1的新型核酸突变检测技术.研究团队发现竟然LbCpf1也具有类似于Cas13a的“collateral effect”效应[62]:LbCpf1与crRNA结合之后,在切割目标双链DNA同时,它还会对单链DNA(ssDNA)任意切割.基于这一特性,他们结合了等温扩增技术将极低浓度的目的片段常温扩增至较高水平[62],开发出被称为“DETECTR”(DNA endonuclease targeted CRISPR trans reporter)的诊断系统,可对血液、唾液、尿液等样本中的少量DNA进行快速、简便地即时分析.研究人员对包含人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)的患者样本运用DETECTR进行了测试.结果显示,可在感染多种不同HPV类型的样本中准确测定出高风险的HPV类型:HPV16和HPV18,确定了DETECTR在诊断方面具有相当高的灵敏度和非常大的实际应用价值.

张锋教授团队在原SHERLOCK(specific high sensitivity enzymatic reporter unlocking)技术的基础上推出了SHERLOCKv2,打造出以Cas13/Csm6和Cas12a(Cpf1)/Csm6为代表的具有更多种检测并行、更低底物检测浓度、更强灵敏度和更简单操作应用四大优势的超级检测系统[63].

虽然已有报道将部分失活的Cas核酸酶与载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽(apolipoprotein B mRNA-editing enzymecatalytic-polypeptide, APOBEC)、活化诱导胞嘧啶脱氨酶(activation-induced cytidine deaminase,AID)或ecTadA(Escherichia coli TadA)融合构建出的碱基编辑器能够实现G·C →A·T或A·T→G·C的碱基转换,但是其使用范围受到PAM序列的限制[64-68].陈佳团队[69]借鉴已有的CRISPR基因编辑技术,开发出新型单碱基编辑系统(Cpf1-BE),该系统能够在Cas9难以识别的A/T富集PAM区域进行单碱基编辑.这两项技术相辅相成,有效地扩大了单碱基编辑技术的功能区域,展现出基因编辑更广阔的前景.

3 CRISPR-Cpf1的缺陷与展望

CRISPR-Cpf1的PAM虽然区别于大多数的CRISPR-Cas9,呈5′端的富含T序列,但是相对固定的PAM序列要求同样限制了Cpf1在实际应用中的靶标选择,某些基因的某些位点会成为阻碍其发挥效应的“盲点”.借鉴前人对SpCas9和SaCas9 PI(PAM-interacting)结构域的改造,科学家可以在已有晶体结构的基础上对Cpf1蛋白进行改造、突变,以此发掘出可兼容多类型PAM的Cpf1蛋白变体,而目前已经有相关AsCpf1突变体的报道[70].

在将Cpf1推向临床应用的过程中,有许许多多的问题需要解决,而脱靶问题就是其中最重要的问题.虽然有报道Cpf1保真性好,但这并不代表Cpf1不存在脱靶.在基因治疗的过程中,任何一个脱靶基因编辑都有可能造成临床副作用.科研工作者能否参考改进SpCas9的手段通过生物工程方法来提高FnCpf1的保真性?笔者实验室最新的结果显示,目前FnCpf1的活性与SaCas9、SpCas9相比仍然不高[71],是否有方法提高其活性,如何更加精确地检测脱靶仍有待研究.

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中国科学院生物物理研究所和中国生物物理学会共同主办
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文章信息

周晨晨, 刘写写, 谢海华, 谷峰
ZHOU Chen-Chen, LIU Xie-Xie, XIE Hai-Hua, GU Feng
CRISPR家族新成员:CRISPR-Cpf1
The New Member of CRISPR Family, CRISPR-Cpf1
生物化学与生物物理进展, 2018, 45(6): 558-592
Progress in Biochemistry and Biophysics, 2018, 45(6): 558-592
http://dx.doi.org/10.16476/j.pibb.2018.0146

文章历史

收稿日期: 2018-04-27
接受日期: 2018-05-14

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