2. 华熙福瑞达生物医药有限公司,济南 250012;
3. 中国科学院生物大分子科教融合卓越中心,北京 100101
2. Bloomage Freda Biopharm Co., Ltd, Jinan 250012, China;
3. CAS Center for Excellence in Biomacromolecules, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China
肠道内数以百亿计的共生菌在机体的营养消化及吸收、能量代谢、免疫系统成熟、抵御感染中发挥重要作用.多种重大疾病的发生发展均与肠道菌群异常相关.肠道菌群会随着生活环境、饮食状况等因素发生动态改变,而肠道黏膜免疫系统在菌群建立、成熟过程中不断与肠道菌相互作用,实现两者的相互制约、相互包容的动态平衡.肠道感染、肠道炎症均会导致肠道稳态失衡.
透明质酸(hyaluronic acid,HA)是由β-D-葡萄糖醛酸和β-D-N-乙酰氨基葡萄糖的双糖单位聚合而成的高分子多糖物质,是细胞外基质的重要组成成分,主要表达在动物包括肠道在内的大部分软结缔组织中,发挥重要的生理功能,例如调节蛋白质、协助水电解质的扩散及运转、润滑关节、调节血管壁的通透性、促进伤口愈合等等.透明质酸由透明质酸合成酶(HA synthases,HASs)在质膜上组装,延伸成多糖进而分泌到胞外空间[1-3],其生理功能的发挥依赖于分子质量大小[4],比如高分子质量(400~20 000 ku) HA大量存在于关节、结缔组织中[4],在损伤和炎症状态下,HA表达上调而后被透明质酸酶降解为小分子片段,低分子质量的短链HA能够诱导巨噬细胞炎性基因表达[5-6].在克罗恩病损伤状态下,低分子质量HA表达增加[7].回肠炎遗传模型中HA和HAS1表达增加,同时肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)过表达[7],说明低分子质量的HA具有促炎作用.而大分子质量的HA能够对肠上皮细胞起保护作用,例如在辐射诱导的肠道上皮损伤模型中,辐射前腹腔注射HA(750 ku)能够缓解辐射引起的肠道上皮细胞凋亡[8],在三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的大鼠结肠炎模型中,联合使用HA (350和2 000 ku)与美沙拉秦(mesalamine)能够使大鼠肠道上皮损伤得到更好的恢复[9],上述研究暗示了大分子质量的HA在控制损伤或炎症中发挥着保护作用.那么大分子质量的HA在肠道中能否通过维持肠道稳态而起到抗感染和炎症的作用呢?
本研究拟分别通过李斯特菌(Listeria monocytogenes,L. monocytogenes)、柠檬酸杆菌(Citrobacter rodentium,C. rodentium)、肠致病性大肠杆菌(enteropathogenic Escherichia coli,EPEC)肠道感染研究大分子质量透明质酸(530 ku)在肠道感染中的作用,以及在硫酸葡聚糖(dextran sulfate sodium,DSS)诱导急性肠炎和慢性肠炎模型中探究大分子质量透明质酸(530 ku)对肠炎的诱导是否有保护作用.
1 材料与方法 1.1 材料野生型C57BL/6J小鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司;透明质酸(分子质量530 ku)由华熙福瑞达生物医药有限公司提供;单增李斯特菌(L. monocytogenes 10403s菌株)由唐宏实验室赠送;脑心浸出液、麦糠凯琼脂购自OXOID公司;柠檬酸杆菌(C. rodentium DBS100菌株)由清华大学郭晓欢实验室赠送;肠致病性大肠杆菌(EPEC E2348/69菌株)由唐宏实验室赠送;硫酸葡聚糖钠购自SIGMA公司.
1.2 实验方法 1.2.1 李斯特菌口服感染实验8周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为2组,一组每天灌胃200 μl 30 mg/kg HA(分子质量为530 ku)水溶液,一组每天灌胃200 μl PBS溶液,连续8d.第9d每只小鼠灌胃200 μl(2 × 109 CFU)的李斯特菌.10 h后取粪便,72 h后取肝脏和脾脏,涂板,分别测粪便和组织中细菌的载量.数据进行统计分析.
1.2.2 鼠柠檬酸杆菌感染实验8周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为2组,一组每天灌胃200 μl 30 mg/kg HA(分子质量为530 ku)水溶液,一组每天灌胃200 μl PBS溶液,连续8d.第9d每只小鼠灌胃200 μl(1 × 1010 CFU)的柠檬酸杆菌.每天称重,第3、5、7、9、11、14d取粪便涂板,测粪便中细菌的载量.数据进行统计分析.
1.2.3 肠致病性大肠杆菌感染实验8周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为2组,一组每天灌胃200 μl 30 mg/kg HA(分子质量为530 ku)水溶液,一组每天灌胃200 μl PBS溶液,连续8d.第9d每只小鼠灌胃200 μl(1 × 1010 CFU)的肠致病性大肠杆菌.每天称重,第6 h、12 h、1 d、2 d取粪便涂板,测粪便中细菌的载量.数据进行统计分析.
1.2.4 DSS诱导慢性肠炎实验8周龄C57BL/6J小鼠随机分成3组,分别为对照组(无DSS),DSS组和口服HA的DSS组(DSS+HA),每组6只.DSS组以2% DSS水溶液为饮用水5d,双蒸水5d,3个循环诱发慢性结肠炎;DSS+HA组以2% DSS和0.25 g/L透明质酸水溶液5d,0.25 g/L HA水溶液5d,3个循环;无DSS组口服双蒸水.肠炎的评估:每日观察和记录小鼠的体重,大便性状和便血情况,进行疾病活动度指数(DAI)评分.
1.2.5 DSS诱导急性肠炎实验8周龄C57BL/6J小鼠随机分成3组[DSS+HA、DSS、NT(Non-treated)],每组6只.DSS+HA组每天口服0.25 g/L透明质酸水溶液,DSS组和NT组口服双蒸水溶液,持续10d.急性DSS处理:DSS+HA组每天口服2.5% DSS和0.25 g/L透明质酸水溶液;DSS组口服2.5% DSS水溶液;NT组口服双蒸水.每日观察和记录小鼠的体重,大便性状和便血情况,进行疾病活动度指数(DAI)评分.
2 结果 2.1 透明质酸在李斯特菌肠道感染中发挥保护作用李斯特菌在免疫低下的人群中可导致脑膜炎等严重的感染,其在4℃的环境中仍可生长繁殖,是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一.我们首先分析了HA是否可以提高小鼠对李斯特菌感染的抵抗能力.发现对小鼠进行肠道感染李斯特菌后,喂食HA(分子质量为530 ku)的小鼠粪便中细菌载量显著低于对照组(图 1a),表明口服HA可提高小鼠对肠道李斯特菌感染的控制能力.
WT mice were oral administrated with PBS or HA for 8 days before Listeria monocytogenes infection by oral gavage. Bacterial loads in feces 24 h post-infection (a), liver (b) and spleen (c) 72 h post-infection. |
鼠柠檬酸杆菌是小鼠肠道病原菌,能够穿过黏液层进入上皮细胞引起结肠炎,常被作为模型用于研究人类病原菌肠致病性大肠杆菌(enteropathogenic Escherichia coli,EPEC)和肠出血性大肠杆菌(enterohaemorrhagic E. coli,EHEC)感染的分子机制.我们发现喂食HA可降低小鼠粪便中细菌载量(图 2a),并改善小鼠感染中的体重改变(图 2b),意味着口服HA可帮助小鼠拮抗鼠柠檬酸杆菌的感染.
WT mice were oral administrated with PBS or HA for 8 days before Citrobacter rodentium infection by gavage, bacterial loads in feces (a) and body weight change (b). |
在观察到HA改善小鼠控制鼠柠檬酸杆菌感染后,我们进一步分析了HA对肠致病性大肠杆菌感染的影响.发现喂饲HA具有降低小鼠粪便中肠致病性大肠杆菌细菌载量的作用(图 3a),并且喂饲HA组的小鼠能够改善由于肠道感染引起的体重降低(图 3b).
WT mice were oral administrated with PBS or HA for 8 days before enteropathogenic Escherichia coli infection by gavage, bacterial loads in feces (a) and body weight change (b). |
在上述研究中,我们发现了喂饲HA改善了小鼠对肠道感染的控制能力.进而分析口服HA是否具有改善损伤诱导肠炎的作用.我们利用了DSS诱发慢性结肠炎,并给小鼠喂饲HA,结果发现喂饲HA组对DSS诱导的慢性结肠炎没有明显的改善作用(图 4).
Body weight change (a) and daily colitis disease activity (b). |
我们进一步分析了HA对DSS诱导的急性肠炎的作用.先给小鼠喂饲了HA,再用DSS诱导急性肠炎,比较了喂饲组和非喂饲组在体重和疾病活动指数评分上的差异,结果显示两者没有显著变化(图 5),说明口服HA对DSS诱导急性肠炎并无显著作用.
Body weight change (a) and daily colitis disease activity (b). |
肠道稳态的建立与维持依赖于肠道的屏障——肠道上皮黏膜层.肠道上皮中的多种细胞(包括普通上皮细胞、杯状细胞、潘氏细胞等)通过分泌黏液及多种抗菌活性物质,构成肠道抵御病原微生物入侵的第一道防线[10-11].HA是双糖单位聚合而成的高分子多糖物质,一方面可能作为“益生元”为肠道共生菌提供多糖类物质促进肠道菌群共生,进而维持更好的肠道稳态;另一方面透明质酸可以吸附在黏膜表面形成生物膜,增强肠道屏障,抵抗病原微生物的进一步刺激,提高了对病原菌的控制能力.
在DSS诱导的结肠炎模型中,能够检测到内源的HA在结肠黏膜下层聚集,同时有大量的炎性细胞浸润[12],阻断HA的受体CD44分子则能够减少炎性细胞的浸润[13-14],说明在炎症状态下,HA起到促炎作用.我们采取DSS造模前持续灌胃大分子质量的HA,并不能缓解DSS诱导的结肠炎,但是也不加重DSS诱导的结肠炎.HA在体内的合成与降解是动态的过程,一方面大分子质量的HA可能对DSS诱导的结肠炎起到一定的保护作用,但大量的HA又能被水解产生更多的小分子质量HA加强了促炎作用,两者的作用可能抵消.而此前的研究发现了大分子质量的HA对TNBS诱导的肠炎有保护作用[9],而我们的结果发现大分子质量的HA对DSS诱导的肠炎没有保护作用,我们猜测其中的可能原因是两者诱导肠炎的病理机制有所不同,比如TNBS诱导的肠炎依赖于CD4 T细胞的活化[15],而DSS诱导了肠炎则主要依赖于天然免疫细胞的活化,如巨噬细胞等等,而CD4 T细胞的作用不大[16].当然其中的具体原因有待更深入的研究.
本研究通过不同的感染和炎症模型,初步解析了透明质酸对肠道屏障功能的促进作用.研究发现,服用HA的小鼠对肠道李斯特氏菌、柠檬酸杆菌、肠致病性大肠杆菌感染控制能力升高,意味着HA对肠道稳态维持发挥着促进作用.这暗示着HA或能通过促进肠道屏障功能,抵抗肠道细菌感染.
[1] |
Flynn R S, Mahavadi S, Murthy K S, et al. Insulin-like growth factor-binding protein-5 stimulates growth of human intestinal muscle cells by activation of G{alpha}i3. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2009, 297(6): G1232-1238. DOI:10.1152/ajpgi.00323.2009 |
[2] |
Karamanos N K, Axelsson S, Vanky P, et al. Determination of hyaluronan and galactosaminoglycan disaccharides by high- performance capillary electrophoresis at the attomole level. Applications to analyses of tissue and cell culture proteoglycans. J Chromatogr A, 1995, 696(2): 295-305. DOI:10.1016/0021-9673(94)01294-O |
[3] |
Tammi R, Saamanen A M, Maibach H I, et al. Degradation of newly synthesized high molecular mass hyaluronan in the epidermal and dermal compartments of human skin in organ culture. J Invest Dermatol, 1991, 97(1): 126-130. DOI:10.1111/1523-1747.ep12478553 |
[4] |
Stern R, Asari A A, Sugahara K N. Hyaluronan fragments: an information-rich system. Eur J Cell Biol, 2006, 85(8): 699-715. DOI:10.1016/j.ejcb.2006.05.009 |
[5] |
Mckee C M, Penno M B, Cowman M, et al. Hyaluronan (HA) fragments induce chemokine gene expression in alveolar macrophages. The role of HA size and CD44. J Clin Invest, 1996, 98(10): 2403-2413. |
[6] |
Mckee C M, Lowenstein C J, Horton M R, et al. Hyaluronan fragments induce nitric-oxide synthase in murine macrophages through a nuclear factor kappaB-dependent mechanism. J Biol Chem, 1997, 272(12): 8013-8018. DOI:10.1074/jbc.272.12.8013 |
[7] |
Majors A K, Austin R C, De La Motte C A, et al. Endoplasmic reticulum stress induces hyaluronan deposition and leukocyte adhesion. J Biol Chem, 2003, 278(47): 47223-47231. DOI:10.1074/jbc.M304871200 |
[8] |
Riehl T E, Foster L, Stenson W F. Hyaluronic acid is radioprotective in the intestine through a TLR4 and COX-2-mediated mechanism. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2012, 302(3): G309-316. DOI:10.1152/ajpgi.00248.2011 |
[9] |
Chiu C T, Kuo S N, Hung S W, et al. Combined treatment with hyaluronic acid and mesalamine protects rats from inflammatory bowel disease induced by intracolonic administration of trinitrobenzenesulfonic acid. Molecules, 2017, 22(6): pii:E904. DOI:10.3390/mdecuders22060904) |
[10] |
Bevins C L, Salzman N H. Paneth cells, antimicrobial peptides and maintenance of intestinal homeostasis. Nat Rev Microbiol, 2011, 9(5): 356-368. DOI:10.1038/nrmicro2546 |
[11] |
Shan M, Gentile M, Yeiser J R, et al. Mucus enhances gut homeostasis and oral tolerance by delivering immunoregulatory signals. Science, 2013, 342(6157): 447-453. DOI:10.1126/science.1237910 |
[12] |
Kessler S, Rho H, West G, et al. Hyaluronan (HA) deposition precedes and promotes leukocyte recruitment in intestinal inflammation. Clin Transl Sci, 2008, 1(1): 57-61. DOI:10.1111/j.1752-8062.2008.00025.x |
[13] |
Nandi A, Estess P, Siegelman M. Bimolecular complex between rolling and firm adhesion receptors required for cell arrest; CD44 association with VLA-4 in T cell extravasation. Immunity, 2004, 20(4): 455-465. DOI:10.1016/S1074-7613(04)00077-9 |
[14] |
Binion D G, West G A, Ina K, et al. Enhanced leukocyte binding by intestinal microvascular endothelial cells in inflammatory bowel disease. Gastroenterology, 1997, 112(6): 1895-1907. DOI:10.1053/gast.1997.v112.pm9178682 |
[15] |
Antoniou E, Margonis G A, Angelou A, et al. The TNBS-induced colitis animal model: an overview. Ann Med Surg (Lond), 2016, 11: 9-15. |
[16] |
Axelsson L G, Landstrom E, Goldschmidt T J, et al. Dextran sulfate sodium (DSS) induced experimental colitis in immunodeficient mice: effects in CD4(+) -cell depleted, athymic and NK-cell depleted SCID mice. Inflamm Res, 1996, 45(4): 181-191. DOI:10.1007/BF02285159 |