摘要:

摘要:小分子非编码RNA，以不同于蛋白质调控因子的全新方式，通过RNA干扰(RNAi)，调控mRNA稳定性、蛋白质合成、染色质的组织和基因组的结构. 由于可方便地施加和释放控制，RNAi已被广泛作为通过沉默作用研究基因功能的手段，并正在被应用于一些重大疾病的诊治. 小分子RNA沉默作用的发挥依赖于一个由多种蛋白质因子组成的RNAi机器. 在过去的几年中，对RNAi机器中重要蛋白质因子的结构功能，及它们在小向导RNA指导下沉默基因表达的分子机制等方面的研究都取得了诸多突破性的进展.

摘要:肿瘤靶向性病毒作为一种特殊的肿瘤治疗药物和基因治疗载体近年来已得到长足发展，许多高效、靶向性病毒载体已被相继研究开发，但仍不能满足临床上肿瘤靶向治疗的需要，如何将这些靶向病毒准确而高效地运输到肿瘤病变部位仍然未得到充分解决. 细胞因子诱导杀伤细胞 (cytokine-induced killer cells，CIK) 作为肿瘤的细胞治疗方法之一已成功地在临床上得到了广泛应用. 最近科学家使用CIK细胞作为病毒运载工具，成功地将病毒运载到肿瘤组织部位并显示出高效的抗肿瘤作用，该方法为病毒运输定位于肿瘤病变部位找到了突破口，实验资料显示其具有潜在的应用价值.

摘要:胶质瘤是最常见的脑肿瘤，前体mRNA可变剪接可能在不同类型胶质瘤的发生、恶化以及侵入中发挥作用. 参与调控胶质瘤中前体mRNA可变剪接的因素包括顺式元件如内含子剪接抑制序列(ISS)、外显子剪接抑制序列(ESS)等，反式因子包括SRp55、SC35、SF2/ASF、PTB等剪接调节因子. 近期的研究进展发现，有多种与胶质瘤相关的基因受到可变剪接的调控，包括肿瘤抑制因子、肿瘤促进因子、酶、受体、离子通道等. 因此，研究胶质瘤中的前体mRNA可变剪接将有利于深入了解胶质瘤发生的分子机制、有利于为胶质瘤的早期诊断和治疗提供新的潜在靶点.

摘要:转化生长因子-β1(TGF-β1/Smads)信号转导通路的持续激活是瘢痕疙瘩形成的重要机制. 研究发现这条通路重要的负反馈调节信号分子Smad7表达明显下调，Smad2/3的磷酸化水平和蛋白质量并无明显改变. 但是，Smad7下调的机制尚不清楚. 采用生物信息学方法对Smad7的启动子进行分析；用RT-PCR和蛋白质印迹分别检测了正常皮肤、正常瘢痕及瘢痕疙瘩组织中的Sp1样转录因子TIEG1 mRNA及蛋白质的表达水平；体外培养正常皮肤、正常瘢痕及瘢痕疙瘩成纤维细胞，检测TIEG1 mRNA及蛋白的表达水平. 研究结果显示，Smad7启动子上有Sp1的位点，TIEG1 mRNA及蛋白质水平在瘢痕疙瘩组织及瘢痕疙瘩成纤维细胞中表达明显高于正常瘢痕和正常皮肤 (P < 0.05). 说明瘢痕疙瘩中TIEG1可能是Smad7下调的重要原因，有必要进一步研究TIEG1对Smad7的调控作用机制.

摘要:为了研究低氧诱导因子 (hypoxia inducible factor-1 alpha，HIF-1α) 在干细胞增殖分化过程中的作用机制，构建了2个HIF-1α慢病毒siRNA干涉载体，并转染人胎儿肝脏基质细胞 (fetal liver stromal cell，FLSC). 根据绿色荧光蛋白的表达评估转染效率后进行流式细胞分选，获得高表达慢病毒干涉载体的细胞. 实时荧光定量PCR和蛋白质印迹检测了转染细胞中HIF-1α基因的干涉效率，结果显示，与对照组相比，常氧下培养的细胞HIF-1α基因表达量仅为其相对表达量的18.8%和25.5%，干涉效率分别为81.2%和74.5%，低氧处理后的细胞HIF-1α相对表达量分别为对照组的21.2%和29.3%，干涉效率分别为78.8%和70.7%，均具有显著差异. 蛋白质印迹结果显示，在蛋白质水平表达也明显受抑制, 且重组干涉质粒pSicoR-HIF-1α1的干涉效应较强. RT-PCR、免疫荧光和ELISA法检测了沉默HIF-1α后胎肝基质细胞衍生因子1α (SDF-1α)在RNA和蛋白质水平的表达变化，干涉后细胞SDF-1α的表达明显减低. 低氧条件下SDF-1α基因的调控作用有可能是通过低氧激活HIF-1α而诱导产生的，HIF-1α在干细胞增殖分化的分子调控机制中具重要作用.

摘要:PCR扩增LasR基因，用反向克隆法构建LasR基因反义核酸原核表达载体pUCP18/lasR^antisense并转化铜绿假单胞菌，经酶切、PCR及测序鉴定重组载体. RT-PCR检测LasB基因和LasI基因mRNA的表达，NAD法测定外毒素A的活性，紫外分光光度计测定绿脓菌素的产生水平. 用转化pUCP18/lasR^antisense质粒菌株感染大鼠呼吸道并进行病理组织切片检查. PCR扩增出约720 bp片段，与GenBank (No：NC_002516)报道的基因片段大小一致，构建了LasR基因反义核酸原核表达载体pUCP18/lasR^antisense，并成功转化铜绿假单胞菌,且有效表达,使转化菌的毒力因子弹性蛋白酶、外毒素A和绿脓菌素表达水平均降低. 与标准株感染的大鼠比较，转化pUCP18/lasR^antisense质粒菌株感染的大鼠支气管炎症明显减轻. 上述结果表明，LasR基因反义核酸原核表达载体pUCP18/lasR^antisense 可以降低铜绿假单胞菌的毒力.

摘要:以THP-1巨噬细胞为研究对象，观察蛋白激酶C (PKC) 激动剂佛波酯 (PMA)和抑制剂钙磷酸结合蛋白C(Calphostin C)对胞膜PKC活性、胞膜PKCα及胞浆内过氧化物酶体增殖物激活受体 (PPARγ) 和adipophilin表达以及细胞内脂质蓄积的影响，初步探讨PKC调控adipophilin表达及脂质蓄积的作用机制. 采用PepTag® Assay、RT-PCR、蛋白质印迹、油红O染色和高效液相色谱法，观察到100 nmol/L PMA在激活胞膜PKC ((0.2514±0.0154) U/ml) 的同时可以与氧化低密度脂蛋白(oxLDL)协同增强PKCα、PPARγ和adipophilin表达并使细胞内脂滴的蓄积极大地增强. 细胞内胆固醇酯/总胆固醇比值增至(69.8±9.5)%；300 nmol/L Calphostin C对荷脂THP-1巨噬细胞的处理则抑制酶活性至((0.0927±0.0056) U/ml，细胞内脂滴减少，胆固醇酯/总胆固醇比值降至(40.1±9.1)%；Calphostin C呈剂量依赖性的方式下调酶活性、PKCα、PPARγ和adipophilin表达，400 nmol/L Calphostin C基本上可以逆转50 mg/L oxLDL诱导的酶活化和PKCα、PPARγ和adipophilin表达的上调. 结果提示，蛋白激酶C活性的改变可以影响adipophilin介导的脂质蓄积， 其中PPARγ可能在这一调控机制中发挥了重要作用.

摘要:为了考察PEG-PEI共聚物作为基因载体介导VEGF165基因的能力，合成不同接枝量的 PEG-PEI共聚物，考察共聚物的细胞毒性，同时采用PCR技术获得上下游含有Hind Ⅲ和BamHⅠ酶切位点的目的基因VEGF165，与pEGFP-C1构建重组质粒pEGFP-VEGF165，将PEG-PEI作为基因载体，与pEGFP-VEGF165通过自组装成DNA复合物，使其转染脐静脉内皮细胞(HUVEc)，测定发荧光细胞百分数获得转染率，利用ELISA、RT-PCR检测VEGF的表达，用MTT法考察VEGF165转染HUVEc后对内皮细胞生长的影响. 结果显示，形成PEG-PEI共聚物后可显著降低PEI的细胞毒性. 作为基因载体介导pEGFP-VEGF165转染HUVEc后，在荧光显微镜下可见强绿色荧光蛋白表达，转染率与接枝PEG的量及N/P有关，PEG-PEI(5-25-1)在N/P=30时转染率达到最大值，比PEI显著提高. 转染后血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达及mRNA水平均有显著提高，且可有效地刺激内皮细胞增殖. 研究表明，PEG-PEI共聚物可做为基因载体，有效地介导pEGFP-VEGF165基因的传递.

摘要:砷化物是广泛应用的抗癌药物，特别是对白血病有显著疗效.然而，治疗过程中病人会因对砷化物具有耐药性而影响治疗效果，而目前对于砷抗性机制尚缺全面深入的研究. 利用酵母作为模式生物，使用不同浓度的砷对由4 757个酵母缺失型突变体组成的菌株库进行筛查. 共鉴定出104个基因/开放阅读框 (ORF)，其缺失导致酵母对砷的抗性增加. 生物信息学分析结果提示，这些基因与mRNA分解代谢、应激反应、组蛋白乙酰化和蛋白质合成及分解代谢等功能有关. 同时这些基因中多于半数具有哺乳动物同源类似物. 所以，进一步研究这些基因有望为人类砷化物的耐药性及毒性机制研究提供富有价值的新线索.

摘要:应用“一个珠子一个化合物”的组合化学肽库，以期筛选得到特异性识别非小细胞肺癌细胞 (A549) 的小分子肽. 初次筛选共得到29个与A549阳性结合的珠子，经氨基酸序列分析后发现含有-NGXG-肽链结构的序列共有10个. 选择cNGQGEQc作进一步的细胞特异性研究，发现cNGQGEQc与非小细胞肺癌A549、Calu-1及H178的粘附特异性明显高于其他细胞系，对cNGQGEQc的结构分析显示，-NGXG-及六肽长度对小分子肽与A549细胞的粘附非常重要. 标记FITC的小分子肽cNGQGEQc能与A549细胞发生特异性结合. 用抗整合素的抗体 (α1～6，αv和β1～5) 阻断小分子肽与A549细胞表面的相应受体结合，结果显示，α3与β亚单位的任何组合均对cNGQGEQc与A549细胞的粘附有明显的阻断作用. 结果表明，小分子肽cNGQGEQc是通过细胞表面整合素α3与非小细胞肺癌A549发生特异性结合.

摘要:根据硫色曲霉木聚糖酶基因xynA和xynB序列设计引物，PCR扩增获得574 bp、594 bp的目的基因片段．两段DNA分别用EcoRⅠ/BamHⅠ、BglⅡ/HindⅢ酶切后，连接到载体pET-28a(+)的多克隆位点，构建了xynA和xynB融合表达载体pET-xynAB，即在木聚糖酶A和B之间引入了7个氨基酸的寡肽序列(GlyGlyGlySerGlyGlyGly)．将pET-xynAB转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导，SDS-PAGE检测到了一条约50 ku的特异性表达条带．Ni-NTA柱纯化后的特异性蛋白经8 mol/L脲素变性，梯度透析使蛋白质复性．酶学性质分析表明，该重组木聚糖酶的最适催化温度为50℃，最适pH值为4.4．在pH 2.4～5.4范围内，酶的相对活性都在75%以上，重组酶在80℃保温30 min还有近50%的残余酶活．不同种类的金属离子对重组酶的活力影响不同．

摘要:小干扰RNAs (siRNAs) 能够有效降解具有互补序列的RNA. 在SARS-CoV的基因组RNA和所有亚基因组RNA的5′ 端均有一段共同的leader序列，而且该leader 序列在不同的病毒分离物中高度保守，因此leader序列可作为一个用于抑制SARS-CoV复制的有效靶点. 研究表明，针对leader序列化学合成的siRNA和DNA载体表达的shRNA 都可以有效抑制SARS-CoV mRNA的表达. Leader序列特异的siRNA或shRNA不仅可以有效抑制leader与报告基因EGFP融合基因的表达，而且还可以有效抑制leader与刺突蛋白 (spike protein)、膜蛋白(membrane protein)和核衣壳蛋白(nucleocapsid protein) 基因的融合转录产物的表达. 结果表明，针对leader序列的RNA干扰可以发展成为一种抗SARS-CoV治疗的有效策略.

摘要:通过鸡催乳素基因编码区基因扫描，发现3个SNP位点，分别是外显子2的C1607T、外显子5的C5749T和T5821C，3个SNP均没有改变氨基酸的编码．同时发现不同的单倍型间存在不同的密码子使用频率．对5个鸡群共370只鸡进行SSCP的基因型检测，共发现7种单倍型，结合44周龄产蛋量分析，发现不同单倍型的平均产蛋量存在显著性差异．结合密码子使用频率分析，发现使用高频密码子的单倍型个体产蛋量相对高．通过酶联免疫方法检测催乳素表达量，结果显示，使用高频密码子的个体，激素水平较高，其中使用2个高频密码子的单倍型个体和使用1.5个密码子的单倍型个体之间存在极显著差异．研究结果表明，密码子使用频率与产蛋量在一定的范围内呈现正相关趋势．

摘要:单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)在对复杂疾病遗传易感性以及基于群体基因识别等方面的研究中起着非常重要的作用，尤其是对复杂疾病遗传易感性的研究，需要对大量样本进行分型. 为了满足这种要求，亟待需要发展一种操作简单、成本较低、适于自动化和高通量的分型技术. 利用磁性颗粒“在位”固相PCR (in situ MPs-PCR) 扩增的靶序列，通过与野生、突变标签探针以及双色荧光 (Cy3，Cy5) 通用检测子杂交实现对样本的分型. 应用该方法，对96个样本的亚甲基四氢叶酸还原酶 (MTHFR) 基因C677T位点的多态性进行了检测，其野生型和突变型样本的正错配信号比大于4.5，杂合型正错配信号比接近1，分型结果与测序结果一致.

摘要:以表面展示人源蛋白酶体α亚基6蛋白的重组酵母细胞，结合酶联吸附免疫原理检测技术，以表面展示有人源蛋白酶体α亚基6 (proteasome subunit alpha 6，PSα 6) 的重组酵母细胞及其对应的单克隆抗体3D7D12D为研究对象，建立酵母酶联免疫吸附 (yeast-ELISA) 检测技术，应用于检测小鼠单克隆抗体及单抗效价. 应用该方法最佳酵母浓度为0.50 A₆₀₀；测得单抗效价为1∶5×10⁵，与常规ELISA效价接近；交叉试验和阻断试验表明该方法特异性强；同时该方法可用于检测抗血清.结果表明，yeast-ELISA可直接应用于检测单抗，测得效价与常规抗原包被间接ELISA具有良好一致性，特异性好，无交叉反应性.