结论
胞质M-CSF通过诱导GLUT-1、HK2和PKM2的表达，活化MCF-7细胞糖酵解途径；PI3K/AKT信号通路参与胞质M-CSF活化MCF-7细胞的糖酵解途径.
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞系
人乳腺癌MCF-7细胞购自Abcam公司.
1.1.2 主要试剂与仪器
ATP检测试剂盒和LY294002购自碧云天生物技术研究所，葡萄糖和乳酸检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，2-脱氧葡萄糖（2-DG）、3-溴丙酮酸（3-BrPA）和5-氟尿嘧啶（5-FU）购自Sigma公司，API-2购自Adooq公司，GLUT-1抗体和PKM2 抗体购自Abcam公司，HK2 抗体购自Proteintech公司，荧光倒置显微镜购自OLYMPUS公司，synergy HT多功能微孔板检测仪购自Bio-Tek公司.
1.2 方法
1.2.1 体外培养人乳腺癌MCF-7和MCF-7-M细胞
人乳腺癌MCF-7细胞、稳定转染M-CSF的MCF-7细胞（MCF-7-M），用含10%新生牛血清的高糖型DMEM培养基，置于 37℃含 5% C
O2 培养箱中常规培养.1.2.2 胞内ATP的检测
取5.0×1
04 个/ml的MCF-7和MCF-7-M细胞以500 μl/孔种植于24孔培养板，培养12 h；加入 20 μl终浓度为20 mmol/L的糖酵解抑制剂2-DG；弃培养液，冰PBS洗两次，加入100 μl/孔裂解液裂解，荧光倒置显微镜下观察直到细胞充分裂解逐渐失去细胞形态；吸取裂解液，4°C，12 000 r/min，离心10 min；吸取样本上清，按ATP检测试剂盒说明书配制ATP检测液，化学发光法检测样本ATP浓度. 重复检测3次．1.2.3 蛋白质印迹检测
提取各组细胞蛋白质，测定蛋白质浓度；取蛋白质样品30 μl进行SDS-PAGE电泳，转膜，封闭；加入一抗（1∶1 000）4℃孵育过夜，TBST液洗膜；加入二抗（1∶2 000）常温孵育 1 h，TBST液洗膜；用电化学发光(electro-chemiluminescence，ECL)化学发光试剂反应，曝光后扫描，采用 AlphaImager2200软件进行蛋白质条带灰度值分析．重复检测3次．
1.2.4 细胞葡萄糖摄入量的检测
取3.5×1
05 个/ml的MCF-7和MCF-7-M细胞以500 μl/孔种植于24孔培养板，培养12 h；提取 20 μl的培养液，设阴性对照组(NC组)和空白组，按葡萄糖测试盒说明书检测各组葡萄糖含量；多功能酶标仪（505 nm）测吸光度（A）值. 计算公式：葡萄糖摄入量/（mmol·L-1 ）= NC 组葡萄糖含量/（mmol·L-1 ）－[（样本A值－空白A值）/（标准品A值－空白A值）×标准品浓度（5.55 mmol/L）].重复检测3次．1.2.5 细胞外乳酸分泌量的检测
取3.5×1
05 个/ml的MCF-7和MCF-7-M细胞以500 μl /孔种植于24孔培养板；分别在6、12、18、24 h提取孔板内培养液20 μl，设空白组，按乳酸测试盒说明书分别检测各组乳酸含量；多功能酶标仪（530 nm）测A值. 计算公式：乳酸含量/（mmol·L-1 ）=（样本A值－空白A值）/（标准品A值－空白A值）×标准品浓度（3 mmol/L）×样本稀释倍数. 重复检测3次．1.2.6 MTT检测
以5×1
03 个/孔的MCF-7-M细胞接种至96孔板，设NC组和空白组，培养12 h；弃培养液，样本组加入200 μl终浓度为30 μmol/L 的3-BrPA，NC组和空白组加入培养液200 μl，培养24 h；弃培养液，样本组加入200 μl终浓度分别为0、6、60、600、6 000、60 000 μmol/L的5-FU，NC组和空白组加入培养液200 μl，培养24 h；不弃培养液，每孔加入20 μl MTT(5 g/L)溶液，培养 4 h；弃培养液，每孔加入150 μl的二甲基亚砜（DMSO）溶解，多功能酶标仪（570 nm）测A值. 计算公式：细胞存活率=（样本组A值－空白组A值）/（NC组A值-空白组A值）．实验重复检测3次．1.2.7 统计学分析
采用 SPSS20.0软件进行统计，所有数据采用单因素方差分析(one way ANOVA)，两组均数比较采用t检验，数据用均数±标准差（x±SD）表示.
2 结果
2.1 胞质M-CSF对MCF-7细胞ATP水平的影响
为了解胞质M-CSF对MCF-7细胞ATP水平的影响，我们常规培养MCF-7和MCF-7-M细胞12 h，用ATP检测试剂盒、化学发光法检测两组细胞ATP的含量. 结果显示，MCF-7和MCF-7-M 细胞的ATP含量分别为（2.153±0.079）μmol/L和（3.765±0.371）μmol/L，MCF-7-M细胞ATP水平明显高于MCF-7细胞（图1，P<0.05）. 结果提示，胞质 M-CSF诱导了MCF-7细胞ATP的产生.
2.2 胞质M-CSF对MCF-7糖代谢的影响
肿瘤细胞主要通过糖酵解和氧化磷酸化两个途径产生ATP，为了解胞质M-CSF诱导MCF-7细胞产生ATP的主要代谢途径，我们分别用浓度为 20 mmol/L的糖酵解抑制剂2-DG和氧化磷酸化抑制剂OLIG处理MCF-7和MCF-7-M细胞6 h，对照组细胞用DMSO处理，检测各组细胞的ATP水平（表1）. 与未做任何处理的MCF-7和MCF-7-M细胞比较，糖酵解抑制剂2-DG降低了MCF-7的ATP水平（图2，P＜0.05），显著降低了MCF-7-M细胞的ATP水平（图2，P＜0.01），而氧化磷酸化抑制剂OLIG和DMSO对MCF-7和MCF-7-M细胞的ATP水平影响均不显著（图2，P>0.05）. 结果提示，糖酵解是MCF-7细胞和MCF-7-M细胞产生ATP的主要途径，氧化磷酸化是次要途径，胞质M-CSF诱导MCF-7细胞主要通过糖酵解途径产生ATP.
Table 1 Effects of cytoplasmic M-CSF on glucose metabolism in MCF-7 cells
GROUP ATP/ (μmol· L-1 )MCF-7 3.891±0.307 MCF-7-M 7.680±0.145 MCF-7+2-DG 2.154±0.033* MCF-7-M+2-DG 3.098±0.035** MCF-7+OLIG 3.112±0.197 MCF-7-M+OLG 6.596±0.416 MCF-7+DMSO 3.750±0.200 MCF-7-M+DMSO 7.135±0.445 NOTE: *P<0.05，MCF-7 vs MCF-7+2-DG；**P<0.01，MCF-7-M vs MCF-7-M+2-DG.
2.3 胞质M-CSF调控MCF-7细胞糖酵解的机制
2.3.1 胞质M-CSF对MCF-7细胞葡萄糖摄取和乳酸分泌的影响
糖酵解能力较强的肿瘤细胞，需要提高其葡萄糖摄取量，同时又会造成其最终代谢产物乳酸的胞外堆积，为探讨胞质M-CSF对MCF-7细胞葡萄糖摄取和乳酸分泌的影响，我们检测了MCF-7和MCF-7-M细胞的葡萄糖摄取和乳酸分泌情况. 结果显示：MCF-7细胞的葡萄糖摄取量为（3.019±0.565）mmol/L，MCF-7-M细胞的葡萄糖摄取量为（6.702±0.045）mmol/L，MCF-7-M细胞的葡萄糖摄取能力显著高于MCF-7细胞(图3a，P<0.01）； MCF-7-M细胞在6、12、18、24 h的乳酸分泌量显著高于MCF-7细胞（表2、图3b，P<0.01）.结果提示，胞质M-CSF增强了MCF-7细胞的葡萄糖摄取和乳酸分泌.
2.3.2 胞质M-CSF对MCF-7细胞糖酵解关键酶HK2和PKM2表达的影响
己糖激酶2（HK2）和丙酮酸激酶M2（PKM2）是细胞糖酵解途径的关键酶，胞质 M-CSF是否通过对HK2和PKM2的诱导来影响MCF-7细胞的糖酵解途径，本实验室使用pCMV/myc/cyto-M-CSF稳定转染MCF-7细胞（MCF-7-M），以转染空载体pCMV/myc/cyto的MCF-7细胞（MCF-7-C）和MCF-7细胞作为对照，用蛋白质印迹法（Western-blotting）检测了各组细胞HK2和PKM2的表达情况. 结果显示，HK2在MCF-7-M细胞的表达高于MCF-7和MCF-7-C细胞(图4，P<0.05），PKM2在MCF-7-M细胞的表达显著高于MCF-7和MCF-7-C细胞(图4，P<0.01），MCF-7与MCF-7-C细胞HK2、PKM2的表达无明显差异(图4，P >0.05). 结果提示，胞质M-CSF诱导了MCF-7细胞糖酵解关键酶HK2和PKM2的表达.
Fig. 4 Cytoplasmic M-CSF induces the expression of HK2 and PKM2 in MCF-7 cells
NOTE:
2.3.3 AKT抑制剂API-2对胞质M-CSF诱导
MCF-7细胞葡萄糖摄取和乳酸分泌的影响
文献证实，PI3K/AKT信号通路能够提升肿瘤细胞糖摄取和乳酸分泌能力，可以直接诱导肿瘤细胞转为有氧糖酵解代谢表型进而促进肿瘤的发展，为探究PI3K/ATK信号通路是否参与胞质M-CSF上调MCF-7细胞的有氧糖酵解，我们用浓度为 20 μmol/L的AKT抑制剂API-2预处理MCF-7和MCF-7-M细胞24 h，对照细胞用DMSO处理，检测各组细胞的葡萄糖摄取量和乳酸分泌量（表3）. 结果显示，MCF-7和MCF-7-M细胞经API-2处理后葡萄糖摄取量和乳酸分泌量均显著降低 （图5，P<0.01），对照组无明显变化（图5，P >0.05）. 结果提示，API-2可抑制胞质M-CSF诱导MCF-7细胞的葡萄糖摄取和乳酸的分泌，PI3K/AKT信号通路在胞质M-CSF诱导MCF-7细胞糖酵解过程中发挥着重要作用.
Table 3 Effect of API-2 on glucose uptake and lactate secretion in MCF-7 and MCF-7-M cells
Group Glucose uptake/（mmol· L-1 ）Lactate secretion/（mmol· L-1 ）MCF-7+DMSO 5.681±0.121 5.001±0.195 MCF-7 5.211±0.243 4.550±0.235 MCF-7+API-2 2.222±0.936** 2.050±0.023** MCF-7-M+DMSO 10.492±0.655 11.294±0.148 MCF-7-M 10.582±0.121 11.832±0.498 MCF-7-M+API-2 5.511±0.918** 3.346±0.2110 ** NOTE: **P<0.01，MCF-7 vs MCF-7+API-2；**P<0.01，MCF-7-M vs MCF-7-M+API-2.
2.3.4 PI3K抑制剂LY294002和AKT抑制剂API-2对MCF-7细胞GLUT-1表达的影响
在肿瘤细胞的糖酵解途径中，葡萄糖需要通过存在于细胞膜上的葡萄糖转运体（GLUT）的跨膜转运作用才能进入细胞内，因此GLUT的活性决定了葡萄糖的摄取能力.为探究PI3K/AKT信号通路是否参与胞质M-CSF诱导MCF-7细胞GLUT-1的表达. 我们分别用DMSO、PI3K抑制剂LY294002和AKT抑制剂API-2预处理MCF-7和MCF-7-M细胞1 h，蛋白质印迹法（Western-blotting）检测各组细胞GLUT-1的表达. 结果显示：MCF-7-M细胞GLUT-1的表达显著高于MCF-7和MCF-7-C细胞（图6，P<0.05）；LY294002和API-2显著抑制了MCF-7-M细胞GLUT-1的表达（图6，P<0.05），DMSO组则变化不明显（图6，P >0.05）. 结果提示，胞质M-CSF可诱导MCF-7细胞GLUT-1的表达，PI3K/AKT信号通路参与胞质M-CSF诱导MCF-7细胞的有氧糖酵解.
Fig. 6 Effect of LY294002 and API-2 on the expression of GLUT-1 in MCF-7 cells
NOTE:
2.3.5 ATP消耗剂3-BrPA增强MCF-7细胞对5-FU的敏感性
本实验室前期已证明胞质M-CSF可以促进MCF-7细胞对5-FU耐药，目前认为肿瘤细胞对抗化疗药物的杀灭过程中均需要ATP的消耗，为探究胞质M-CSF诱导MCF-7细胞对5-FU耐药是否与有氧糖酵解产生大量的ATP有关，我们用浓度为20 μmol/L的ATP消耗剂3-BrPA预处理MCF-7和MCF-7-M细胞24 h，加入不同浓度梯度的5-FU检测细胞存活率. 结果显示，在5-FU作用下，经 3-BrPA预处理的MCF-7和MCF-7-M细胞存活率均出现了明显下降（图7、表4，P<0.01）. 结果提示，3-BrPA可显著增强MCF-7细胞和MCF-7-M细胞对5-FU的敏感性.
3 讨论
糖代谢是肿瘤细胞获取ATP的主要途径，包括糖酵解和氧化磷酸化两个途径.在肿瘤细胞的发生发展过程中，往往会通过自然选择强化糖酵解功能而弱化线粒体氧化磷酸化功能，这是因为糖酵解非常适应肿瘤细胞生长、增殖需要快速大量生成ATP的要求. 此外，肿瘤细胞通过糖酵解代谢中间产物的积累可以增加还原型辅酶Ⅱ（NADPH）和核糖的产生，这有助于形成肿瘤细胞生长和增殖所必需的生物大分子. 因此，糖酵解的能量供应以及合成代谢对肿瘤细胞生长和分裂是关键因
素[11] ，可以通过抑制参与糖酵解途径的关键酶和抑制糖代谢来发挥抗肿瘤作用[12] . 研究证实，M-CSF在多种癌细胞中高度表达[13] . M-CSF可以促进乳腺癌的发生发展，在癌变的乳腺细胞中高表达，而在正常的乳腺细胞中低表达[14] . 有趣的是，肿瘤糖代谢已被认为是肿瘤细胞促生长促增殖的主要原因之一[15] . M-CSF是否可以调控肿瘤细胞的糖代谢？本实验室使用pCMV/myc/cyto-M-CSF稳定转染MCF-7细胞（MCF-7-M），以转染空载体pCMV/myc/cyto的MCF-7细胞（MCF-7-C）和MCF-7细胞作为对照，结果发现胞质M-CSF诱导了MCF-7细胞的ATP产生. 为了进一步探究胞质M-CSF是对MCF-7细胞糖代谢的哪个代谢途径产生了影响才最终使ATP产生量增加，我们分别用糖酵解抑制剂2-DG和氧化磷酸化抑制剂OLIG处理MCF-7和MCF-7-M细胞，发现2-DG显著降低了MCF-7和MCF-7-M细胞的ATP水平，而OLIG对MCF-7和MCF-7-M细胞的ATP水平影响均不显著. 因此我们认为，胞质M-CSF诱导MCF-7细胞ATP的产生主要通过糖酵解途径，线粒体氧化磷酸化是辅助途径.HK2和PKM2是糖酵解途径中的两个关键酶，HK2的蛋白质表达升高会使癌细胞的糖酵解能力增
强[16] ， PKM2同样直接起到维持肿瘤细胞糖酵解表型的功能[17] ，HK2和PKM2的表达是评价糖酵解活性的主要标准. 我们通过实验发现，胞质 M-CSF上调了MCF-7细胞HK2的表达，显著上调了PKM2的表达，而且胞质M-CSF显著促进了MCF-7细胞的葡萄糖摄取和乳酸分泌. 这些结果充分证明，胞质M-CSF上调了MCF-7细胞的糖酵解.胞质M-CSF活化PI3K/AKT信号通路是本实验室前期的成果. 众多研究发
现[18,19,20] ，PI3K抑制剂LY294002和AKT抑制剂API-2可以通过调控肿瘤细胞的糖酵解途径以影响肿瘤的发生发展. 为了探究PI3K/ATK信号通路是否参与胞质M-CSF上调MCF-7细胞的糖酵解途径，我们使用AKT抑制剂API-2处理MCF-7和MCF-7-M细胞，发现API-2可抑制胞质M-CSF诱导MCF-7细胞的葡萄糖摄取和乳酸分泌，提示AKT参与MCF-7和MCF-7-M细胞有氧糖酵解的调控. 进一步实验发现，MCF-7-M细胞GLUT-1的表达显著高于MCF-7和MCF-7-C细胞，而LY294002和API-2可以显著抑制MCF-7-M细胞GLUT-1的表达，提示PI3K/AKT信号通路参与胞质M-CSF诱导MCF-7细胞GLUT-1的蛋白质表达增加. 综上所述，我们认为PI3K/AKT信号通路参与胞质M-CSF诱导MCF-7细胞的糖酵解途径.目前认为，癌细胞面对化疗药物的杀灭，至少会有一种应对方式：增加药物排出、降低胞内药物活性、强化DNA损伤修复和激活抗凋亡基因的表达等，所有的这些应对方式都要消耗ATP. 我们推测胞质M-CSF诱导MCF-7细胞对5-FU耐药的重要原因是胞质M-CSF通过活化MCF-7细胞的糖酵解而显著增加胞内ATP水平，从而将大量的ATP用于应对5-FU杀灭. 为验证这种假设，我们用ATP消耗剂3-溴丙酮
酸[21] 处理MCF-7和MCF-7-M细胞.结果发现，3-BrPA可显著增强MCF-7细胞和 MCF-7-M细胞对5-FU的敏感性. 因此我们推定，糖酵解的提升增加了MCF-7细胞ATP的生成，降低了对5-FU的药物敏感性，从而促进了MCF-7细胞的生存能力.综上所述，我们证实胞质M-CSF通过上调HK2、PKM2和GLUT-1的表达，增加葡萄糖摄取，促进ATP的产生，产生药物抵抗，使乳腺癌细胞生存能力得到极大增强，从而降低治疗预后.研发能够靶向抑制乳腺癌细胞相关糖酵解酶或ATP的抗癌药物，或是未来乳腺癌治疗的一个新的切入点.
TANG Sheng-Song. corresponding author:Tel: 86-745-2377102, E-mail: tangss111@163.comMO Zhong-Cheng. Tel: 86-745-2377102, E-mail: zhchmo@hotmail.com
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摘要
本文探讨巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）对人乳腺癌MCF-7细胞糖代谢的影响及其机制. 构建胞质稳定转染 M-CSF的MCF-7细胞（MCF-7-M）；ATP检测试剂盒检测MCF-7和MCF-7-M细胞的ATP生成；葡萄糖测定试剂盒、乳酸测试盒检测MCF-7和MCF-7-M细胞的葡萄糖摄取和乳酸分泌情况；蛋白质印迹法检测在糖酵解抑制剂2-脱氧葡萄糖（2-DG）和氧化磷酸化抑制剂OLIG处理后，M-CSF对MCF-7细胞的糖酵解关键酶：己糖激酶2（HK2）、丙酮酸激酶M2（PKM2）及葡萄糖转运体1（GLUT-1）表达的影响；MTT法检测在ATP消耗剂3-溴丙酮酸（3-BrPA）处理后，MCF-7和MCF-7-M细胞对5-FU敏感性的变化. 结果发现：MCF-7-M细胞的ATP水平显著高于MCF-7细胞（P<0.05）；2-DG降低了MCF-7和MCF-7-M细胞的ATP水平，并且降低MCF-7-M细胞ATP的效果更明显（P<0.01）；MCF-7-M细胞的糖摄取能力和乳酸分泌量显著高于MCF-7细胞（P<0.01），经API-2处理后，MCF-7和MCF-7-M细胞葡萄糖消耗和乳酸分泌量均显著减少（P<0.01）；MCF-7-M细胞GLUT-1、HK2和PKM2的表达显著高于MCF-7细胞（P<0.01）；LY294002和API-2均可抑制MCF-7-M细胞GLUT-1的表达（P<0.05）；用3-BrPA处理后，MCF-7-M和MCF-7细胞对5-FU的药物敏感性显著增强（P<0.01). 综上，得出
Abstract
To explore the effect and mechanisms of cytoplasmic M-CSF on glucose metabolism in human breast cancer MCF-7 cells, MCF-7 cells stable expressing cytoplasmic M-CSF were constructed. Relative ATP content was measured by ATP assay kit, glucose was measured using glucose assay kit and lactate was measured using lactate acid assay kit. The expression of HK2, PKM2 and GLUT-1 in three kinds of cell with LY294002 or API-2 was detected by West-blotting. The sensitivity of MCF-7 and MCF-7-M cells to 5-FU with the treatment of ATP depletion by 3-BrPA was observed by MTT assay. It was found that the ATP level of MCF-7-M cells was significantly higher than that of MCF-7 cells (P<0.05); 2-DG decreases the ATP level of MCF-7 and MCF-7-M cells, and the effect of lowering the ATP level of MCF-7-M cells is more obvious (P<0.01). The glucose uptake and lactate secretion of MCF-7-M cells were significantly higher than those of MCF-7 cells (P<0.01). After the treatment with API-2, the glucose consumption and lactate secretion of MCF-7 and MCF-7-M cells were significantly reduced (P<0.01). The expressions of GLUT-1, HK2 and PKM2 in MCF-7-M cells were significantly higher than those in MCF-7 cells (P<0.01). Both LY294002 and API-2 inhibited the expression of GLUT-1 in MCF-7-M cells (P<0.05). After the treatment with 3-BrPA, the drug sensitivity of MCF-7-M and MCF-7 cells to 5- FU was significantly enhanced (P<0.01). In conclusion, cytoplasmic M-CSF activates glycolysis by induce GLUT-1, HK2 and PKM2 protein expression in MCF-7 cells; PI3K/AKT signaling involves the pathway that glycolysis was activated by cytoplasmic M-CSF in MCF-7 cells.
Keywords
M-CSF; MCF-7 cells; MCF-7-M cells; glycolysis; PI3K/AKT signaling
唐圣松. 通信作者:Tel: 0745-2377102, E-mail: tangss111@163.com;
莫中成. Tel: 0745-2377102, E-mail: zhchmo@hotmail.com
研究发
