NRSF慢病毒干涉载体的构建及功能初步检测

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NRSF慢病毒干涉载体的构建及功能初步检测
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作者:
                        
                        
                    
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基金项目:国家高技术研究发展计划(863)领域重大专项资助项目(2006AA02A107)，国家重点基础研究发展计划(973)(2005CB522702)和国家自然科学基金资助项目(30470831).

Construction and Function Study of NRSF Lentiviral RNA Interference Vector

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This work was supported by grants from National Hi-Tech Research and Development Program of China (2006AA02A107), National Basic Research Program of China (2005CB522702) and The National Natural Science Foundation of China (30470831).

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摘要:

为研究神经元限制性沉默因子(NRSF)负调控神经元及胰岛细胞中神经特异性基因的表达，拟通过RNAi的方法降低NRSF表达以进一步观察其调控的下游基因的表达情况．构建含人胰岛素启动子-荧光素酶(HIP-LUC)的pcDNA3.1报告载体．通过RNAi序列设计软件进行NRSF干涉片段及脱靶对照片段的设计，然后构建慢病毒干涉载体．包装产生慢病毒干涉毒液，用其感染HeLa细胞获得稳定干涉NRSF的细胞株，利用RT-PCR、实时定量PCR、蛋白质免疫印迹、免疫荧光染色等方法检测NRSF的干涉效果及其下游基因的表达情况，观察干涉NRSF后胰岛素启动子报告载体荧光素酶活性的变化．构建具有NRSF干涉效果的慢病毒干涉载体成功，并获得了稳定干涉NRSF及脱靶对照的HeLa细胞株，RT-PCR及实时定量PCR检测结果表明，NRSF干涉片段的干涉效率为56% (n = 6, P < 0.01)，蛋白质免疫印迹、免疫荧光染色方法检测证实干涉后NRSF蛋白表达水平明显降低．RT-PCR实验表明干涉NRSF后下游基因开始表达，荧光素酶活性分析表明，干涉NRSF后胰岛素启动子活性增强了2.4倍 (n = 3，P < 0.01)．上述结果表明，成功构建NRSF的慢病毒干涉载体并获得稳定干涉NRSF的HeLa细胞株，干涉NRSF后，其下游基因特别是胰岛素基因开始表达．这一研究工作有助于我们进一步了解NRSF在胰岛细胞发育分化中的调控作用．

Abstract:

The transcriptional repressor RE1 silencer transcription factor (NRSF/REST) is an important factor that restricts some neuronal traits in neurons. It has been confirmed that the insulin gene was regulated by NRSF via NRSE. Here, the relationship between NRSF and insulin gene was investigated by means of RNA interference (RNAi). The expression of NRSF was down-regulated by lentiviral RNA interference vector, and the interference efficiency is 56% (n = 6, P < 0.01). When the expression of NRSF was down-regulated, genes regulated by NRSF, such as SCG10, BDNF, pax4 and insulin, began to express in HeLa cells. The human insulin promoter activity was up-regulated 2.4-fold after RNA interference (n = 3, P < 0.01), confirmed by dual-luciferase assay.

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杨印祥,李艳华,刘庆斌,张赛男,陈琳,吕洋,白慈贤,南雪,裴雪涛. NRSF慢病毒干涉载体的构建及功能初步检测[J].生物化学与生物物理进展,2008,35(2):151-158

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收稿日期:2007-06-16
最后修改日期:2007-10-11
接受日期:
在线发布日期: 2008-02-03
出版日期: 2008-02-20

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