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1 材料与方法
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1.1 藻种与莱茵衣藻的培养
莱茵衣藻CC-124藻种购于美国莱茵衣藻中心（http://www.chlamycollection.org/），在Tris-acetate-phosphate (TAP
)[26] 固体培养基上划线获得单克隆，取单克隆藻细胞接种于含200 mL TAP液体培养基的500 mL 三角瓶中悬浮振荡培养（120 rpm），培养温度25 °C，24小时持续光照，光照强度为100 µmol·m-2 ·s-1 .预培养3天，OD750 达到0.2-0.3后，离心（800×g，5 min）收集微藻，分别用TAP正常或缺氮（培养基中不添加NH4 Cl成分）液体培养基重悬浮，漂洗2次后，将莱茵衣藻在200 mL 正常或缺氮培养基培养，分别于0、1、2、4和6天取材，拍照记录表型，光学显微镜下用血球计数板计数，取30 mL 培养物经2，000×g 离心 10 min，收集至2 mL Eppendorf管中，-70 °C冻存待用.所用试剂均购于上海生工生物工程有限公司. -
1.2 莱茵衣藻培养的生长曲线
用紫外/可见分光光度计（Unico WFJ 7200）测量培养物在波长750 nm的光密度值（O
D750 ），绘制生长曲线，每个实验重复三次并计算平均值和方差. -
1.3 油脂含量测定
莱茵衣藻三酰甘油（TAG）含量的测定方法参照文
献[27] ，主要步骤为：将5 mL藻培养物经800×g，5 min离心收集，重悬浮于等体积PBS缓冲液（2.7 M NaCl，8.1 mM Na2 HPO4 ，1.5 mM KH2 PO4 ，2.7 mM KCl，pH 7.4）中，加入终浓度为20%的DMSO和尼罗红染料（终浓度1 μg/mL），震荡混匀，40 °C温浴10 min，用荧光分光光度计（Shimadzu RF-6000）在激发波长为485 nm，发射波长580 nm处检测得到中性脂的相对荧光强度，根据标准曲线计算TAG含量.每个实验重复三次，计算平均值和方差. -
1.4 总蛋白质提取及定量
莱茵衣藻总蛋白质的提取方法按参考文
献[27] ，主要步骤为：将冻存的莱茵衣藻沉淀用1 mL蛋白质提取缓冲液（60 mM DTT，60mM Na2 CO3 ，2% SDS（w/v）和12% 蔗糖（w/v））重悬浮，加入总体积约100 µL的氧化锆珠，在高通量组织研磨仪（鼎昊源 TL2010）中剧烈震荡20分钟，4 °C，10，000 × g离心，收集上清，按照1:4加入5×上样缓冲液（250 mM Tris-HCl（pH 6.8），10% SDS（w/v），0.5% 溴酚蓝（w/v），50% 甘油（v/v）和5% β-巯基乙醇（w/v）），沸水浴10分钟，-20 °C冻存待用.蛋白质相对定量采用SDS-PAGE分离全蛋白质，凝胶浓度10%，上样量20 μL，电压160 V，电泳时间1小时，具体步骤参考文献[9] .电泳结束后将凝胶浸泡于新鲜配制的考马斯亮兰染色液（1 L：Coomassie Brilliant Blue R-250（上海生工） 2.5 g，甲醇450 mL，冰醋酸100 mL，蒸馏水450 mL）中，染色2小时后转移至脱色液（1 L：冰醋酸130 mL，甲醇300 mL，蒸馏水570 mL）中，在脱色摇床中脱色至条带和背景清晰，用Minichem 610凝胶/化学发光成像仪（北京赛智生物技术公司）拍照，使用Image J软件[28] 采集信号进行相对比较. -
1.5 候选蛋白质及抗体的选择
20个候选蛋白质及抗体信息，包括每个蛋白质的Au10_locus ID、预测的亚细胞定位、注释及分子量、制备抗体所用的免疫原、免疫多肽的序列等见文
献[19] . -
1.6 免疫印迹检测
免疫印迹（WB）实验步骤参照文
献[9] .SDS-PAGE分离全蛋白质，上样量10µL，电泳条件160 V，时间1-1.5小时，采用湿转方法将蛋白质转移至PVDF膜上，转膜条件100V恒压1小时.使用5%脱脂牛奶的TTBS溶液（20mM Tris-HCl（pH 7.5），500 mM NaCl，0.05% Tween 20）封闭1小时，一抗（北京华大蛋白质研发中心有限公司制备）按1:5000稀释于5%脱脂牛奶中，孵育3小时，TTBS洗膜3次，每次5分钟，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（北京华大蛋白质研发中心有限公司）按1:15000稀释于5%脱脂牛奶中，孵育1小时，TTBS洗膜3次，每次5分钟，将600 μL发光液（康为世纪）均匀滴加在膜上，用Minichem 610凝胶/化学发光成像仪（北京赛智生物技术公司）检测信号.对于分子量小于30 kD的蛋白质，采用Tricine-SDS-PAGE[29,30] 分离全蛋白质，80 V电泳30分钟，160 V电泳2.5小时，后续转膜、孵育等步骤与普通SDS-PAGE一致. -
1.7 蛋白质表达丰度相关性分析
用Image J 软件采集获得总蛋白质、目标蛋白质信号强度，用IBM SPSS V24 （IBM 公司，Armonk，纽约，美国）软件计算总蛋白质含量和候选蛋白质丰度之间的皮尔森相关系数（PCC）.为了便于比较，对WB信号进行了归一化处理，即将0时间点的信号强度定义为1，据此计算其他时间点的相对信号值，用归一化后的WB信号代表候选蛋白质的表达丰度.
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1.8 平均相对倍率变化的计算
平均相对倍率变化（ARF）的计算按如下公式：
其中，I(Treatment)为缺氮胁迫第1、2、4或6天归一化后的WB信号强度，I(CK)为正常培养样品中归一化后的WB信号强度.
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2 结果与分析
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2.1 莱茵衣藻缺氮胁迫后表型特征
正常培养及缺氮胁迫的莱茵衣藻在不同时间点的外观形态见图1A，O
D750 生长曲线见图1B，细胞数的变化曲线见图1C，油脂含量变化见图1D.正常培养的莱茵衣藻在6天的生长过程中细胞逐渐增多，颜色由浅绿逐渐变为深绿，OD750 值从0.21上升至1.21，细胞数从0.7×106 /mL上升到3.3×106 /mL.缺氮胁迫条件下培养物颜色由浅绿色变化黄绿色，OD750 从0.21缓慢升至0.41，细胞数从0.7×106 /mL上升到1.5×106 /mL.由此可见，缺氮胁迫后细胞数增长几乎停滞，细胞内叶绿素的合成也受到强烈抑制.同时，计算单位细胞中的中性脂相对含量（图1D）可知，正常培养条件下，由于细胞数的增加，单位细胞内中性脂相对含量下降36%，而缺氮胁迫6天，单位细胞内中性脂含量升高2.37倍，所以缺氮胁迫显著提高了莱茵衣藻的油脂含量.
Fig. 1 The influence of nitrogen (N) depletion stress on the growth of C. reinhardtii cells
注：
NOTE: A: Morphology alterations of C. reinhardtii grown in N-depleted medium. Each samples were collected at the set time points in the experiment, the photos were taken with digital camera Canon A100. +N: control; -N: N-depleted stress. D0, D1, D2, D4 and D6 are culture time (days).B: The influence of N-depletion stress on the optical density (OD) of C. reinhardtii. The optical density at 750 nm (O
D750 ) of the culture were determined by the ultraviolet-visible spectrophotometer, the bar graph was drawn with Microsoft Excel 2016. X- and Y-axes on the graph correspond to culture days and OD750 , respectively. Black bar, control; blank bar, N-depleted stress. Data are mean ± SD of three independent experiments.C: The influence of N-depletion stress on the cell number of C. reinhardtii. Cell number of batch culture was counted using hemocytometer under microscope, the bar graph was drawn with Microsoft Excel 2016. X- and Y-axes on the graph correspond to culture days and cell number, respectively. Black bar, control; blank bar, N-depleted stress. Data are mean ± SD of three independent experiments.D: The influence of N-depletion stress on the content of triacylglycerol (TAG) of C. reinhardtii. The intracellular TAG was stained with Nile red and quantified using spectrophotometer, TAG content per cell was calculated, the bar graph was drawn with Microsoft Excel 2016. X- and Y-axes on the graph correspond to culture days and fold change of TAG content per cell. Black bar, control; blank bar, N-depleted stress. Data are mean ± SD of three independent experiments. -
2.2 缺氮胁迫对莱茵衣藻总蛋白质含量的影响
氮是植物生长发育必需的大量营养元素之一，主要参与蛋白质和叶绿素的合成.在培养的不同时间点提取莱茵衣藻的总蛋白质，通过SDS-PAGE分离后考染（图2A），用Lane 1D软件采集考染信号并进行定量比较（图2B），由图2可见，在正常培养条件下，总蛋白质含量随时间延长逐渐升高，培养6天单位体积内总蛋白质含量升高到2.69倍，在缺氮胁迫条件下，总蛋白质含量下降到54%.
Fig. 2 The influence of nitrogen (N) depletion stress on the total protein content of C. reinhardtii
注：
NOTE: A: Extracted total protein was separated by SDS-PAGE and stained with Coomassie brilliant blue. +N: control; -N: N-depleted stress. D0, D1, D2, D4 and D6 are culture time (days). B: Quantitative comparison of total protein content of C. reinhardtii determined by Coomassie brilliant blue. Signal intensities were extracted by ImageJ software, and showed as relative protein abundance. The intensity of 0 day was set to 1, the fold change of 1, 2, 4 and 6 day to 0 day were calculated. X- and Y-axes on the graph correspond to culture days and fold change of total protein content, respectively. Black bar, control (+N); blank bar, N-depleted stress (-N). Data are mean ± SD of three independent experiments.
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2.3 缺氮胁迫条件下候选蛋白质的表达特征
用20个候选蛋白质的特异抗体，对正常培养和缺氮胁迫共10份蛋白质样品进行总计200个泳道的免疫印迹分析，WB结果见图3,由图3可见，二个蛋白质IC2和FKBP12（Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP-type）未检测到信号，其他18个候选蛋白质均检测到清晰的WB信号条带.在正常培养的材料中，大都检测到候选蛋白质条带信号的增加，在缺氮胁迫的样品中，大部分蛋白质条带的信号下降，但有三个蛋白质ATPs-β（ATP Synthase CF1 beta subunit）、GAP2（Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase 2）和RMT1（Rubisco large subunit N-methyltransferase 1））的条带信号缺氮胁迫上调，另外，在ATPs-6的WB检测结果中，有分子量不同的缺氮诱导条带.13个蛋白质检测到单一主带，5个蛋白质检测到2条主带，其中TUB1、FAB2（Plastid acyl-ACP desaturase 2）和MPC1（Mitochondrial phosphate carrier protein 1）的WB结果中有分子量不同但平行变化的二条主带.
Fig. 3 Western blot detection of candidate proteins in C. reinhardtii cells
C. reinhardtii cells cultured under control and N-depleted stress condition were collected at five time points. Total proteins were extracted and separated by SDS-PAGE. PVDF-membrane-immobilized proteins were detected by antibodies against each 20 candidate proteins. Culture conditions and time points were labeled on the top of each WB results, and the name of proteins were labeled under the WB results. +N: control; -N: N-depleted stress. 0, 1, 2, 4 and 6 are culture time (days). The arrows indicate the bands of candidate proteins.
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2.4 内参蛋白质的鉴定
内参蛋白质是在特定条件下蛋白质丰度保持稳定的蛋白质，在多个时间点的样品中，应该是与总蛋白质丰度变化相关性高的蛋白质.为了鉴定莱茵衣藻缺氮胁迫的内参蛋白质，本研究计算了候选蛋白质丰度变化与总蛋白质含量之间的皮尔森相关系数（PCC）（表1）.由表1可见，在正常培养条件下，Histone H3、RBCL和BCR1（Biotin carboxylase 1, ACCase complex 1）蛋白质的表达丰度与总蛋白质呈现极显著正相关，可作为正常培养条件下的内参蛋白质首选，在缺氮胁迫条件下，Histone H3、HSP70A和FAB2蛋白质的表达丰度与总蛋白质含量呈现极显著正相关，可作为缺氮胁迫的内参蛋白质. Histone H3、RBCL和BCR1在正常和缺氮胁迫条件下均与总蛋白质含量变化呈现极显著或显著正相关，可作为二种条件下的内参蛋白质.
Table 1 Correlation analyses between abundance of candidate proteins and total protein content of C. reinhardtii cells
Name +N -N D0 D1 D2 D4 D6 PCC D0 D1 D2 D4 D6 PCC HISTONE 1.00 1.45 1.49 1.52 1.54 0.96** 1.00 0.32 0.10 0.09 0.09 0.97** TUB1 1.00 1.07 1.33 1.29 1.40 0.87 1.00 1.02 0.59 0.60 0.49 0.88* FAP127 1.00 1.19 1.42 1.47 1.57 0.95* 1.00 0.04 0.01 0.01 0.01 0.89* IC2 — — — — — — — — — — — — FKBP12 — — — — — — — — — — — — RCK1 1.00 1.18 1.21 1.29 1.34 0.95* 1.00 0.46 0.36 0.08 0.09 0.92* HSP70A 1.00 1.06 0.97 0.98 1.00 -0.12 1.00 0.59 0.29 0.28 0.28 1.00** HSP90B 1.00 1.21 1.17 1.18 1.19 0.89 1.00 0.36 0.21 0.20 0.18 0.96* D1 1.00 1.16 1.31 1.41 1.34 0.90* 1.00 0.44 0.33 0.05 0.03 0.92* OEE2 1.00 1.86 2.31 2.39 2.49 0.97* 1.00 0.87 0.81 0.18 0.09 0.68 RBCL 1.00 1.38 1.43 1.55 1.56 0.98** 1.00 0.48 0.37 0.04 0.02 0.91* RBCS2 1.00 1.11 1.14 1.48 2.32 0.75 1.00 0.89 0.57 0.55 0.33 0.89* ATPs-6 1.00 6.12 11.56 12.77 12.74 0.94* 1.00 0.58 0.43 0.13 0.05 0.75 ATPs-A 1.00 1.11 1.13 1.14 1.14 0.95* 1.00 0.29 0.24 0.15 0.09 0.92* ATPs-β 1.00 1.01 1.02 1.01 1.02 0.84 1.00 2.44 32.58 236.74 468.02 -0.55 BCR1 1.00 3.36 3.99 3.80 3.86 0.94** 1.00 0.11 0.12 0.11 0.11 0.88* FAB2 1.00 1.19 1.21 1.20 1.19 0.71 1.00 0.63 0.38 0.36 0.35 0.99** GAP2 1.00 0.87 0.19 0.10 0.09 -0.84* 1.00 4.73 6.40 8.39 8.53 0.94* MPC1 1.00 4.23 11.46 17.25 17.39 0.88* 1.00 0.48 0.45 0.04 0.03 0.87 RMT1 1.00 1.19 1.31 1.41 1.58 0.96* 1.00 1.33 1.62 2.25 3.50 -0.67 Total Protein 1.00 2.01 2.13 2.34 2.49 1.00** 1.00 0.97 0.93 0.87 0.54 1.00**
注：
NOTE: The signal intensities from Western blot in Fig. 3 were extracted by ImageJ software. IBM SPSS statistics v. 24 (IBM Corp. Armonk, NY, USA) was used to calculate Pearson’s correlation coefficient (PCC) between normalized Western blot intensity of candidate protein and total protein content. To normalize the intensity of Western blot, intensity at day 0 from different blots was averaged and set to 1, and intensity at days 1, 2, 4, and 6 was calculated accordingly.**: significant at the 0.01 level; *: significant at the 0.05 level; —: Not detectable. +N: control; -N: N-depleted stress. D0, D1, D2, D4 and D6 are culture time (days).
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2.5 标志物蛋白质的鉴定
标志物蛋白质是在特定条件下变化倍率最大的蛋白质，在多个时间点的样品中，则是以平均相对变化倍率（ARF）作为筛选的指标，图4展示了每个候选蛋白质的ARF数值，由图4可见，在缺氮胁迫条件下， ATPs-β、GAP2和RMT1蛋白质的ARF值分别为180.59、52.90和12.48，明显高出其他蛋白质，由此，根据缺氮胁迫条件下蛋白质的丰度变化幅度，可把ATPs-β、GAP2和RMT1选做缺氮胁迫的标志物蛋白质.
According to the formula (1) described in the method section 1.8, Average relative fold change (ARF) was calculated as follows: Western blot signal intensities of 4 time points (day 1, 2, 4 and 6) were normalized based on the signal on day 0, which was set to 1. Relative fold change were calculated with (I(Treatment)-I(CK))/I(CK), where I(Treatment) and I(CK) are the normalized Western blot signal in N-depleted and control samples, respectively. The average relative fold change at 4 time points were calculated and then the bar graph was drawn. X- and Y-axes on the graph correspond to protein names and ARF, respectively.
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2.6 标志物蛋白质在缺氮胁迫早期的表达特征
为了比较标志物蛋白质在缺氮胁迫过程中出现的时间，采集了缺氮胁迫早期（48h内）的正常培养和缺氮胁迫的莱茵衣藻样品，提取蛋白质后进行了WB分析（图5）.由图5可见，肉眼可区分的ATPs-β、GAP2和RMT1的缺氮诱导条带出现的时间分别是8、18和12小时，可以认为，ATPs-β是出现最早的缺氮诱导标志物蛋白质.
Fig. 5 The abundance alteration of candidate biomarker proteins at the early stage of N-depleted stress
注：
NOTE: Upper panel：Bar graph. Fold change of abundance alteration of candidate biomarker proteins. Western blot signals intensities were extracted by ImageJ software, the fold change at each time points compared to the signal at day 0 were calculated (Y-axes). Data are mean ± SD of three independent experiments.Lower panel: Western blot results. The abundance of candidate biomarker proteins detected by WB (ATPs-β, GAP2 and RMT1) at the early stage of N-depleted stress and control. 0, 2, 4, 8, 12, 24 and 48 are culture time (hours). Each bar corresponds to one Western blot lane.
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3 讨论
氮是植物生长必需的大量营养元素之一，缺氮会严重影响植物的生
长[31] .为应对缺氮胁迫，保证个体在不良环境下存活，植物会做出应答反应，如诱导应答基因的转录或转录后调控、降低新陈代谢水平等[4] .在莱茵衣藻等微藻中，缺氮胁迫往往也伴随着油脂含量的升高。本研究比较了正常培养和缺氮胁迫条件下莱茵衣藻的生长指标、总蛋白质含量及油脂含量等特征，采集了不同时间点的样品，提取蛋白质后进行了20个候选蛋白质的免疫印迹分析，获得了这些蛋白质的丰度变化信息，通过计算候选蛋白质丰度与总蛋白质含量之间的相关性，提出了推荐的内参蛋白质，通过计算缺氮胁迫条件下候选蛋白质丰度变化的平均相对变化倍率，鉴定到缺氮胁迫的蛋白质标志物，为进一步开展莱茵衣藻缺氮胁迫应答过程中的蛋白质的功能研究提供了便利，也将为缺氮介导的油脂合成机理研究提供一个观察指标.根据候选蛋白质的预测功能，可将20个候选蛋白质分为结构、分子伴侣、光合作用、代谢相关和其他5类.结构类蛋白质中，Histone H3和FAP127分别参与染色体的组装和鞭毛的生
长[32,33] ，这2个蛋白质在正常培养条件下表达丰度增加，1天后趋于稳定表达，在缺氮胁迫条件下，蛋白质的表达明显受到抑制，丰度迅速下降，说明缺氮胁迫可能加速这2个蛋白质的降解.TUB1在正常条件下表达稳定，在缺氮条件下并未受到明显抑制，而是维持在一个相对稳定的水平，说明TUB1对缺氮胁迫并不敏感.分子伴侣和光合作用类蛋白质在正常生长条件下均有不同幅度的积累，在缺氮胁迫条件下合成均受到抑制.代谢类蛋白质中，ATPs-6和ATPs-β属ATP合成酶的亚基[4,34] ，检测到了缺氮诱导上调的条带，提示这2个蛋白质可能通过调节ATP水平参与莱茵衣藻缺氮胁迫应答，且对缺氮应答发挥正调控作用.ATPs-A和BCR1的合成受缺氮胁迫所抑制.在“其他”类蛋白质中，甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAP2和核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶转甲基酶RMT1蛋白质均检测到缺氮诱导上调的条带，提示这2个酶可能在缺氮胁迫应答中也发挥正调控作用.在FAB2和MPC1的WB结果中，除检测到符合理论分子量的条带外，在更高分子量位置也检测到清晰的条带，提示这2个蛋白质可能存在修饰或二聚体现象.值得注意的是，ATPs-6和GAP2的缺氮诱导条带与正常培养材料中的条带相比，发生了分子量的变化，说明这2个蛋白质可能是以某种修饰形式参与到缺氮胁迫应答过程中的.内参蛋白质是指在特定条件下表达量稳定或者说与总蛋白质含量相关的蛋白质，本研究中鉴定到Histone H3、RBCL和BCR1在正常和缺氮胁迫条件下与总蛋白质含量变化呈现极显著或显著正相关，被选做二种条件下的内参蛋白质.以前我们曾报道在多种非生物逆境胁迫下，TUB-1、RBCL和ATPs-6 被选做内参蛋白质，比较可见，RBCL可以是共同的内参蛋白质，这个内参蛋白质具有相当广泛的适应性，二种条件下内参蛋白质并不完全重合，说明内参蛋白质是条件依赖的，不同的处理应该采用不同的内参蛋白质.
本研究鉴定的缺氮胁迫标志物蛋白质是ATPs-β、GAP2和RMT1，我们曾报道的非生物逆境胁迫的标志物蛋白质有HSP90B、FAP127 和ATPs-A等，它们适合多种胁迫处理条件，具体到每种胁迫处理的标志物蛋白质为：RCK1是暗处理特异的标志物, BCR1是冷处理特异的标志物，MPC1是热处理特异的标志物，RMT1在添加葡萄糖的处理中显著升
高[19] .比较可见，缺氮胁迫的标志物是独特的，实际上，培养基中添加葡萄糖会增加油脂的含量，所以RMT1在糖处理中显著升高与本实验结果是吻合的，实验结果为RMT1在油脂合成途径中发挥作用提供了又一个独立的证据.ATPs-β和GAP2作为缺氮胁迫标志物都是特异的，且这二个蛋白质在6天时的变化倍率分别为180.59和52.90倍，远高于RMT1（12.48倍）.另外，比较变化倍率可见缺氮胁迫的三种标志物的变化倍率大于非生物逆境胁迫，从一个侧面说明了这些标志物的可靠性.这三个蛋白质标志物在缺氮胁迫中显著诱导上调，说明他们发挥一定作用，有进一步探究其功能的价值.从缺氮胁迫早期各标志物的表现来看，在处理后8小时，即可从WB信号中检测到ATPs-β蛋白质的变化，所以从变化倍率的幅度和出现变化的时间二方面来讲，ATPs-β蛋白质都应该是最优先推荐的缺氮胁迫标志物蛋白质.ATPs-β蛋白质参与组装线粒体
F1 F0 ATP合成酶（复合体V），对维持呼吸作用效率、ATP合成以及线粒体嵴的正常结构起重要作用[36] ，与位于叶绿体和液泡中的ATP合成酶亚基相比，线粒体中的ATP合成酶亚基对光、碳源和氮源的变化更敏感[37] .质谱数据显示，在莱茵衣藻CC-125中，与正常氮源（400 mg/L NH4 Cl）相比，低浓度氮源（200 mg/L和100 mg/L NH4 Cl）可诱导ATPs-β蛋白质表达上调[38] ；利用iTRAQ技术调查莱茵衣藻CC-400缺氮0、0.5、1、2、4、6、12和24小时的蛋白质组变化，发现ATPs-β在缺氮胁迫24小时后可被检测到上调信号[39] .Goold等利用高强度光照诱导莱茵衣藻细胞中油脂积累，并分离了油体（Lipid droplets，LD）进行蛋白质组学分析，鉴定到大量的ATPs-β，提示该蛋白质很有可能参与油脂合成过程[40] .在本研究中，WB实验在缺氮胁迫8小时检测到ATPs-β的诱导表达，所以该蛋白质不但是缺氮胁迫的标志物，还可能从某种程度上与油脂含量的升高直接相关.在本研究中，IC2和FKBP12这二个蛋白质未检测到可见信号，另外在暗、冷、热、盐和糖等处理中也没有检测到它们的表达信
号[19] .IC2是在鞭毛中特异表达的蛋白质，在全蛋白质样品中可能相对含量较低，导致WB信号不明显[18] .FKBP12是雷帕霉素的靶蛋白质，可能其本底表达较低，或许需要某种条件的诱导[40] 。当然，期望所有抗体都检测到清晰的信号也是不太现实的。本文中有一些WB检测到多个条带，如ATPs-6、FAB2和GAP2等，产生这种现象的原因比较复杂，如可能的修饰、蛋白质的聚合体、蛋白质的降解产物或不同拼接体等，甚至仅仅是非特异的杂交条带。后续研究中可以对这些条带信息进行深入挖掘。植物处于逆境胁迫时，通过积累中性脂，即三酰甘油（TAG）的方式存储碳源和能量，避免细胞受到氧化损
伤[41] .在这个过程中，甘油醛三磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）催化合成三磷酸甘油，为三酰甘油的合成提供甘油骨架[42] .对等鞭金藻Isochrysis galbana IOAC724S[43] 和小球藻Chlorella UTEX29[42] 进行缺氮胁迫，均可检测GAPDH的上调表达.在莱茵衣藻中，GAPDH家族共有4个成员，分别为GAP1（Cre12.g485150）、GAP2（Cre07.g354200）、GAP3（Cre01.g010900）和GAP4（Cre12.g556600）[34] ，在糖类代谢和脂类代谢之间起枢纽作用，质谱分析结果显示GAP4受缺氮诱导上调表达[4] .在本研究中，GAP2的免疫印迹结果表现为在缺氮18小时检测到可见信号，且表达上升明显，为揭示该蛋白质参与中性脂的合成提供了证据.RMT1为Rubisco大亚基甲基转移酶1，催化合成大亚基中的三甲基赖氨
酸[44] .莱茵衣藻Sta 6-1在缺氮胁迫应答过程中，叶绿体内的Rubisco参与合成磷酸丙糖，磷酸丙糖在磷酸丙糖异构酶的作用下首先形成二羟丙酮磷酸，继而形成三磷酸甘油，三磷酸甘油离开叶绿体后，在细胞质中参与合成油体（Lipid bodies，LB）[45] .本研究中，RMT1蛋白质在缺氮胁迫12小时检测到诱导条带，表明该蛋白质可能对缺氮诱导的油脂合成过程起正调控作用.综上，本研究对莱茵衣藻在正常和缺氮培养条件下培养物的表型、细胞密度、叶绿素含量、油脂含量和总蛋白质含量进行了检测，鉴定到胁迫过程中伴随着油脂含量的显著升高，进而采用基于抗体的蛋白质组学策略，通过多个时间点样品的系统WB分析，从20个候选蛋白质中筛选鉴定了缺氮胁迫的内参和标志物蛋白质，所积累的抗体资源和蛋白质表达信息可供研究同行参考，所采用的研究策略也具有更为广泛的应用，获得的内参和标志物蛋白质对了解缺氮应答及油脂合成机理可能提供帮助.
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参 考 文 献
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摘要
微藻被认为是最有潜力的生物能源原料之一，了解油脂合成机理、提升油脂合成的效率是重要的生物学问题．莱茵衣藻缺氮胁迫是油脂合成机理研究的模式系统，组学研究已经积累了大量的数据，但针对莱茵衣藻缺氮介导的油脂合成过程的内参及标志物蛋白质还鲜有报道．本研究对莱茵衣藻进行了对照和缺氮胁迫培养，比较了多个时间点(0、1、2、4 和 6d)在 2种处理条件下的培养物表型、细胞密度、油脂含量以及总蛋白质含量的变化等特征．结果显示：莱茵衣藻细胞在受到缺氮胁迫后表现为培养物颜色由绿变黄；A750和细胞计数结果显示细胞生长趋于停滞；尼罗红染色定量实验鉴定到油脂含量的显著升高；考马斯亮蓝染色实验检测到总蛋白质含量降低．以 20 个莱茵衣藻蛋白质为候选，利用蛋白质印迹技术(Western blot,WB)检测了其在不同处理和不同时间点的表达特征变化，通过计算总蛋白质和候选蛋白质含量的皮尔森相关系数(Pearson’scorrelation coefficient， PCC)筛 选 了 莱 茵 衣 藻 缺 氮 胁 迫 的 内 参 蛋 白 质 ， 发 现 Histone H3、 RBCL(ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit)和 BCR1(biotin carboxylase，ACCase complex 1)在对照和缺氮胁迫条件下均与总蛋白质含量变化呈现极显著或显著正相关，所以被选作内参蛋白质．进而通过比较候选蛋白质的平均相对倍率变化(average relative fold change， ARF)， 鉴 定 了 莱 茵 衣 藻 缺 氮 胁 迫 的 标 志 物 蛋 白 质 ， 发 现 ATPs-茁 (ATP synthase CF1 beta subunit)、 GAP2(glyceraldehyde 3-phosphate dehydratase 2)和 RMT1(rubisco large subunit N-methyltransferase 1)蛋白质的 ARF 值分别为 180.59、52.90 和 12.48，明显高出其他蛋白质，由此把它们选做缺氮胁迫的标志物蛋白质．接下来，对缺氮胁迫早期(0、2、4、8、12、18、24 和 48 h)的样品进行蛋白质印迹法分析，发现可检测的 ATPs-茁、GAP2 和 RMT1 的缺氮诱导条带出现的时间分别是 8、18 和 12 h．综上可以认为，在所有候选蛋白质中，ATPs-茁 是出现最早且变化幅度最大的缺氮处理标志物蛋白质．本研究鉴定的内参和标志物蛋白质对了解缺氮应答及油脂合成机理会有所帮助，所积累的蛋白质表达信息可供研究同行参考．
Abstract
Due to the relatively high lipid productivity, microalgae are promising raw material for biofuel production. The understanding for the mechanism of lipid biosynthesis is an important concern which may contribute to the increase of lipid production. Chlamydomonas reinhardtii under nitrogen depletion condition is a model system to investigate the pathway of lipid biosynthesis. Substantial amount of data has been accumulated using “omics” approaches recently, however, the identification of reference and biomarker proteins in nitrogen depletion-mediated triacylglycerol biosynthesis in C. reinhardtii is limited. In this study, C. reinhardtii CC-124 grown in control and nitrogen depleted medium were surveyed to compare the morphology, cell density, lipid content, and total protein content at multiple time points (0, 1, 2, 4 and 6 days). Under nitrogen depletion treatment, the culture turned yellow from green and the O
Progress in Biochemistry and Biophysics
由于微藻具有生长速度快、油脂产量高、不与人争粮、不与粮争地等特点，被认为是最有潜力的生物能源原料之一.了解油脂合成机理，提升油脂合成的效率是重要的生物学问题.莱茵衣藻是微藻生物学研究的模式生物，广泛应用于胁迫应答、光合作用、呼吸过程、油脂合成及鞭毛运动等重要生物学过程的机理研究.在缺氮胁迫培养条件下，莱茵衣藻和多种微藻都会表现油脂含量升高.多年来，莱茵衣藻缺氮胁迫诱导油脂合成的途径一直是人们研究的热点，了解缺氮胁迫介导的相关基因的表达变化是油脂合成机理研究的重要内容.除了油脂含量升高这一典型特征外，在缺氮胁迫条件下，莱茵衣藻细胞还表现为叶绿体呼吸增强，类囊体成分改
Knepper等于2011年最早提出了基于抗体的蛋白质组学策
尽管越来越多的内参蛋白质及标志物蛋白质被鉴定，但针对莱茵衣藻缺氮胁迫内参及标志物蛋白质的了解还很有限.本研究对莱茵衣藻进行了正常和缺氮胁迫培养实验，记录比较了多个时间点在2种处理条件下的培养物表型、细胞密度、油脂含量以及总蛋白质含量的变化等特征，鉴定到在缺氮胁迫过程中伴随着油脂含量的显著升高。用20个莱茵衣藻蛋白质为候选，利用免疫印迹（Western blot, WB）技术检测了其表达特征的变化，通过计算总蛋白质和靶蛋白质含量的皮尔森相关系数（Pearson’s correlation coefficient, PCC）筛选了莱茵衣藻缺氮胁迫的内参蛋白质，通过比较候选蛋白质的平均相对变化倍率（Average relative fold change, ARF），鉴定了莱茵衣藻缺氮胁迫的标志物蛋白质.这些结果可用于莱茵衣藻缺氮应答机理研究，也可供研究同行在莱茵衣藻油脂合成机理研究中应用.
