2003, 30(3):331-334.
摘要:冠状病毒被认为是新近爆发的严重急性呼吸道综合征的病原体.迄今公共数据库中已发表了不同国家和地区分离的12个SARS病毒株基因组完整序列.突起蛋白是冠状病毒的主要抗原,包含许多抗原决定簇.SARS冠状病毒突起蛋白的相对保守性为有效疫苗的开发奠定了很好的研究基础.灭活或减毒的冠状病毒疫苗存在一定的局限性和危险性.开展基因工程疫苗和核酸疫苗的制备研究以及相关候选疫苗的联合应用研究将是一个切实可行的途径.
张勇 , 徐静怡 , 邓巍 , 张楠 , 蔡伦 , 赵义 , 卜东波 , 陈润生
2003, 30(3):335-338.
摘要:RNA干涉(RNA interference, RNAi)是一种特异性地导致转录后基因沉默的现象,在哺乳动物细胞中小分子干扰RNA双链体(small interfering RNA duplexes, siRNA duplexes)可以有效地诱导RNAi现象,为一些疾病的治疗开辟了新的途径.针对SARS冠状病毒(SARS coronavirus, SARS-CoV)中编码5个主要蛋白质的基因,用生物信息学的方法设计了348条候选siRNA靶标.在理论上,相应的siRNA双链体能特异地抑制SARS-CoV靶基因的表达,同时不会影响人体细胞基因的正常表达,这为进一步siRNA类药物的实验研究提供了理论基础.
2003, 30(3):339-343.
摘要:酸敏感离子通道(ASICs)是一类由胞外酸化所激活的阳离子通道.目前,已发现了6个ASICs亚基,它们在外周和中枢神经系统中广泛表达.利用基因敲除等技术,已证明它们在触觉、痛觉、酸味觉以及学习记忆中具有重要作用.同时,它们也参与某些病理反应.ASICs可以被神经肽、温度、金属离子和缺血相关物质等调控,从而整合细胞周围的多种信号以行使其功能.
2003, 30(3):344-349.
摘要:越来越多的微生物基因组序列数据为系统地研究基因的调节和功能创造了有利条件.由于蛋白质是具有生物功能的分子,蛋白质组学在微生物基因组的功能研究中异军突起、蓬勃发展.微生物蛋白质组学的基本原则是,用比较研究来阐明和理解不同微生物之间或不同生长条件下基因的表达水平.显而易见,定量分析技术是比较蛋白质组学中急需发展的核心技术.对蛋白质组学定量分析技术在微生物蛋白质组研究中的进展进行了综述.
2003, 30(3):350-356.
摘要:蛋白质磷酸化是生物体内存在的一种普遍的调节方式,在细胞信号传递中占有极重要的地位.质谱已逐渐被人们认为是挑战这一领域的有利工具.综述了目前利用质谱技术分析磷酸化蛋白质的方法,包括利用固定化的金属亲和层析柱、抗体和化学标签技术富集目的分子,肽片段质量图和前体离子扫描(precusor ion scans)等技术检测磷酸化肽段,串联质谱对磷酸化肽段测序鉴定磷酸化位点,以及引入质量标签对蛋白质的磷酸化水平进行定量等.虽然现在已经有很多可行的方法用于分析磷酸化蛋白质,但要达到从少量生物样品中解析其全部磷酸化蛋白质仍需要有很多技术上的突破.
2003, 30(3):357-362.
摘要:人类神经退行性疾病是一类以神经元退行性病变导致个体行为异常乃至死亡为主要特征的疾病.果蝇以其独特的分子遗传学优势成为研究人类神经退行性疾病的理想模型.通过对果蝇模型的研究不仅可以揭示神经退行性疾病发生的细胞分子通路,还可以研究对疾病有调控作用的基因及其表达产物,寻找可能的药物作用靶点并进行药物筛选,为防治人类神经退行性疾病提供新的方法和有效的药物.
2003, 30(3):363-369.
摘要:Ⅰ型内含子核酶作为最早被发现的RNA催化剂,在过去20年里得到了深入研究.相关研究成果使人们在RNA的生物学功能、催化特征、结构与折叠特征等方面的认识有了革命性更新.回顾了Ⅰ型内含子核酶研究的主要进展,重点对近年来在Ⅰ型内含子核酶的结构和折叠方面所取得的重要成果进行了介绍、分析和总结.
2003, 30(3):370-374.
摘要:近年来,科学家在许多真核生物中发现了一类能时序调控发育进程,长度约为21个核苷酸的小分子RNA,并称其为miRNA(microRNA).最近研究表明,它与早先在RNAi(RNA interference)中发现的siRNA(small interfering RNA)具有很大的相关性,并在不同水平上参与了生物体内的遗传调控和基因重组等重要过程.miRNA基因调控的特殊方式,高度的保守性,可能的加工机制以及它的发现所引发的讨论已引起人们的普遍关注.
2003, 30(3):375-378.
摘要:微囊蛋白(caveolin)基因家族已鉴定出3个成员:微囊蛋白-1、微囊蛋白-2、微囊蛋白-3,并被定位于抑癌基因位点区域.微囊蛋白-1是细胞质膜微囊的标记蛋白,其中间疏水区域在细胞膜内形成发夹结构,并使其N端区域与C端区域在细胞膜内表面聚合形成支架结构.微囊蛋白-1与微囊蛋白-2以组成异源寡聚体的形式存在,在脂肪细胞、内皮细胞和成纤维细胞中表达最丰富,微囊蛋白-3则特异表达于肌肉.离体与活体研究结果均表明微囊蛋白-1可能具有抑癌功能,并可能在细胞信号传导中起刹车作用.微囊蛋白-1基因敲除小鼠心血管NO与Ca2+信号途径受损、功能异常,肺泡上皮细胞出现异常扩增,脂质代谢失衡,身体消瘦.微囊蛋白-2基因敲除小鼠肺功能与耐力均严重受损,与微囊蛋白-1基因敲除小鼠的表型非常相似.微囊蛋白-3为维持心脏正常功能所必需,可能还与一些肌肉营养不良症有关.
赖秋安 , 刘彦信 , 郝雪梅 , 唐爱辉 , 卫威 , 王世强 , 孙久荣
2003, 30(3):379-383.
摘要:通过荧光分子标记和CONFOCAL技术检测方法,建立了TRAIL(TNF-related apoptosis inducing ligand, 一种类肿瘤坏死因子)诱导Novikoff细胞凋亡的模型,并探讨了TRAIL诱导凋亡的机制和Ap5A(P1, P5-Di(adenosine-5′)pentaphosphate)在其中的作用.结果显示:TRAIL可诱导Novikoff细胞凋亡,且具有剂量和时间依赖性,同时胞内钙离子浓度显著上调.Ap5A能延迟TRAIL诱导的Novikoff细胞凋亡,同时下调胞内钙离子浓度.TRAIL和Ap5A分别上调和下调胞内钙离子浓度的作用可能是其诱发和延迟Novikoff细胞凋亡的一个机制.
周继勇 , 陈吉刚 , 王金勇 , JIMMY KWANG
2003, 30(3):384-389.
摘要:鸡白细胞介素2(chIL-2)是近年来新发现的一类细胞因子.根据Sundick等发表的鸡IL-2基因序列设计一对特异性引物,从ConA体外激活的脾淋巴细胞中提取mRNA,通过RT-PCR方法分别扩增和克隆了我国仙居鸡、丝羽乌骨鸡两个地方品种和艾维茵商品肉鸡IL-2 cDNA.仙居鸡、丝羽乌骨鸡和艾维茵商品肉鸡IL-2基因的编码区均由429 nt组成,编码一个由143个氨基酸组成的前体蛋白.基因5′端含有17个核苷酸,3′端含有285个核苷酸组成的非编码区,3′-UTR中含有5个重复的“ATTTA”序列.编码蛋白氨基酸与来自GenBank的Kestrel、Obese和SC品系的来杭鸡比较,氨基酸的突变主要发生在28~32位.而这一区域仙居鸡和丝羽乌骨鸡的编码氨基酸序列与Kestrel来杭鸡相同,艾维茵商品肉鸡与Obese和SC来杭鸡相同.基因系统进化树分析表明,仙居鸡、丝羽乌骨鸡和Kestrel来杭鸡具有很近的亲缘关系,艾维茵商品肉鸡与Obese和SC来杭鸡具有很近的亲缘关系.中国的药用鸡品种——丝羽乌骨鸡在非常保守的133位发生了氨基酸突变.
袁灿 , 吕青兰 , 陈广文 , 刘瑛 , 王尧玲 , 刘海军 , 邹江 , 肖献忠
2003, 30(3):390-394.
摘要:采用反复短时间结扎及松解左冠状动脉前降支构建大鼠心肌缺血预适应动物模型,运用抑制消减杂交技术建立大鼠心肌缺血预适应诱导表达上调基因的消减cDNA文库,通过反向RNA点杂交对部分文库基因进行差异表达初筛,选取表达差异最明显的85个基因进行测序,获得了31个核编码基因和18个新基因(EST),核编码基因中有相当一部分与细胞保护或信号转导有关,新基因已被GenBank收录.从已测序基因中任选5个进行RT-PCR检测,并任选2个进行RNA印迹检测,均证实在缺血预适应时表达增高.上述结果为进一步深入研究缺血预适应心肌保护作用的分子机制和克隆新的缺血预适应相关基因提供了重要信息.
2003, 30(3):395-400.
摘要:研究磺酰化乳糖基神经酰胺(SM3)的表达水平与肝癌细胞转移潜能的关系.采用免疫荧光染色和细胞酶联免疫两种方法,观察了不同转移潜能的肝癌细胞中磺酰化乳糖基神经酰胺的表达水平,发现高转移性肝癌细胞表达SM3的水平明显高于低转移性肝癌细胞.高转移性肝癌细胞经过10 μmol/L维甲酸处理,抑制肝癌细胞的转移潜能以后,SM3的表达水平显著下降(P<0.05),接近低转移性肝癌细胞水平,但是SM3的前体分子半乳糖基神经酰胺水平并不降低,提示磺酰化作用受到了抑制.通过脑苷脂磺酰基转移酶(CST)基因的转染,使Hep3B肝癌细胞高表达SM3.发现CST转染的肝癌细胞与转移相关的行为显著改变,经黏附试验发现,CST基因转染的肝癌细胞对层粘连蛋白和玻连蛋白(vitronectin)的黏附显著增强,比未转染的或转染载体的肝癌细胞升高3~4倍.裸鼠体内试验表明,这种具有高度表达CST基因的Hep3B细胞比对照组细胞具有更高的转移能力(P<0.05).说明磺酰化乳糖基神经酰胺可能与肝癌细胞的转移有关.
2003, 30(3):400-400.
摘要:
熊炜 , 曾朝阳 , 肖炳燚 , 熊芳 , 聂新民 , 范松青 , 彭聪 , 李伟芳 , 王蓉 , 沈守荣 , 李小玲 , 李桂源
2003, 30(3):401-405.
摘要:NOR1基因是中南大学湘雅医学院肿瘤研究所克隆的一个鼻咽癌表达下调新基因,生物信息学预测NOR1基因含有硝基还原酶结构域,该基因可能参与亚硝胺类化学致癌物在体内的代谢过程,从而与鼻咽癌的发生密切相关.通过采用病例-对照的研究方法,利用测序技术对144名鼻咽癌患者和匹配的144名正常人NOR1基因编码区单核苷酸多态(coding region single nucleotide polymorphisms, cSNPs)进行基因分型,关联分析结果显示所检测到的两个cSNPs之间存在连锁不平衡,且均与鼻咽癌发病相关,两个cSNPs及它们所组成的单倍型相对危险度分别为1.36、1.64和1.37.两个cSNPs的多态性改变均使NOR1基因编码蛋白一级结构发生了变化,这种改变可能影响NOR1基因编码蛋白的结构和功能.研究进一步支持了NOR1基因与鼻咽癌的发生发展可能存在密切的关系.
2003, 30(3):406-411.
摘要:用GM-U74A基因芯片分别检测了正常对照组(db/m小鼠)、糖尿病肾病组(db/db小鼠)、大黄酸治疗组(大黄酸150 mg/kg治疗12周)肾脏基因表达谱.发现在12 437个基因(包括表达序列标签)中,与正常对照组相比,糖尿病肾病组有1 085个基因表达下调,37个基因表达上调,其中变化幅度大于2倍,表达下调的有166个和表达上调的有29个.与糖尿病肾病组相比,大黄酸治疗组有384个基因表达下调,155个表达上调,其中变化幅度大于2倍,表达下调的有47个和表达上调的有30个.在此基础上,对其中的一个差异表达的表达序列标签(EST)进行了详细的生物信息学分析,发现它是一个未知功能基因——“REKEN cDNA 0610006H10”基因的一部分.在用RT-PCR进一步验证了其与糖尿病肾病的相关性后,对“REKEN cDNA 0610006H10”基因进行了克隆.
2003, 30(3):412-415.
摘要:生物芯片技术和DNA计算分别是近年来生命科学与信息科学的新兴研究领域,对信息高度并行的获取与处理是二者的本质特性.而0-1规划问题作为运筹学中一个重要的问题,到目前为止还没有好的算法.在DNA计算和DNA芯片基础上,提出了基于DNA芯片解决0-1规划问题的DNA计算新模型,与以往DNA计算模型相比,该模型具有高信息量和操作易自动化的优点.同时指出DNA芯片技术有望作为新型生物计算的芯片.
2003, 30(3):422-426.
摘要:探讨幽门螺杆菌(Hp)保守区(AB)蛋白的体外安全性、免疫原性和黏附作用,以确定AB在Hp疫苗研制中的应用价值.ELISA法测定Hp感染者血清中抗AB抗体,四唑盐比色法(MTT)测定T细胞对AB的增殖反应,流式细胞术检测AB致T细胞表达FasL的作用,二苯胺(DPA)法测定AB致T细胞凋亡率,光镜计数法研究AB抗体对Hp与胃癌细胞黏附的影响.ELISA法共检测了55份血清,以快速尿素酶实验(RUT)作为平行对照,两法的评价判断一致性程度的指标卡帕系数为0.76. 同时,低剂量AB即可刺激Hp+T细胞的增殖.体外安全性实验表明,AB无明显调节T细胞表达FasL的作用以及无明显致Hp-T细胞凋亡的作用. AB抗血清能部分阻断Hp与胃癌细胞系的黏附,在光镜下表现为经抗AB兔血清预处理后,每细胞周围黏附的细菌数较免疫前兔血清预处理组显著减少(P<0.05).研究表明AB是安全的、具有免疫原性的Hp菌体成分,既可以刺激体液免疫,又能够提高细胞免疫,并且其抗体还可防止Hp与胃上皮细胞的黏附.
2003, 30(3):427-430.
摘要:hhlim是从胎儿心脏中新近分离和克隆得到的与心脏发生相关的基因,其表达产物作为转录因子参与多种基因的转录调控和细胞的发育与分化过程.用细胞转染方法将外源性hhlim基因导入原代心肌细胞,发现该基因强制性表达可使心肌细胞体积明显增大.RT-PCR和蛋白质印迹结果表明,hhlim促心肌细胞肥大与诱导α-肌动蛋白(α-actin)过表达及重新启动胚胎期表达基因脑钠肽(BNP)表达有关.用可表达hhlim反义RNA的真核表达载体转染心肌细胞后,致心肌细胞肥大因子ET-1对BNP和α-actin表达的诱导受到显著抑制.这些结果表明,ET-1促进BNP和α-actin表达及引发心肌肥大的效应可能由hhlim所介导,提示hhlim表达与心肌细胞肥大的启动有关.单独或共转染转录因子hhlim、Nkx2.5、GATA-4表达质粒和BNP转录调控区指导的报告基因结果显示,hhlim强制性表达不仅能直接激活BNP基因表达,而且与NKx2.5具有协同作用.结果表明,hhlim可以通过直接或与Nkx2.5协同作用激活BNP基因的表达.
2003, 30(3):431-434.
摘要:探讨了马肝醇脱氢酶(HLADH)催化三甲基硅乙酮及其碳结构类似物不对称还原反应动力学.结果表明,在酶浓度低于150 mg/L时,底物浓度与反应初速度的关系符合米氏动力学方程;HLADH催化三甲基硅乙酮不对称还原反应的Km、vmax和Ea分别为2.67 mmol/L、0.118 mmol/(L·min·mg)和37 kJ/mol, 其碳结构类似物的相应值分别为3.56 mmol/L、0.084 mmol/(L·min·mg)和61 kJ/mol.
吴衡 , 沈敏雄 , 梁玉龙 , 段玲玲 , 王丽影 , 徐贞 , 查锡良
2003, 30(3):435-441.
摘要:表皮钙粘蛋白(E-cadherin)阴性的乳腺癌细胞株MDA-MB-231和MDA-MB-435转染野生型表皮钙粘蛋白基因,通过流式细胞仪测量细胞周期发现表皮钙粘蛋白阳性细胞生长变慢,更多细胞停滞在G0/G1期,蛋白质印迹证实由G0/G1期进入S期的重要调控分子细胞周期蛋白-D1(cyclin D1)下降了,并发现表皮钙粘蛋白还能降低直接激活细胞周期蛋白-D1基因转录的β-连环蛋白的蛋白质浓度.蛋白激酶B(PKB)能通过抑制糖原合成激酶-3β(GSK-3β)的活性来抑制β-连环蛋白降解,并在乳腺癌高转移细胞株中普遍过表达,其表达同样受到了表皮钙粘蛋白的抑制.并且在表皮钙粘蛋白阳性细胞中,作为PKB上游信号分子并能激活PKB的粘着斑激酶 (FAK) 和整联蛋白相关激酶(ILK)蛋白量也发生下降,能抑制PKB激活的PTEN蛋白量却增加了.结果显示,表皮钙粘蛋白能通过降低乳腺癌细胞中的PKB蛋白浓度,并通过上游信号分子抑制PKB的激活,进而降低PKB对β-连环蛋白降解的抑制作用,导致β-连环蛋白直接调控的靶基因细胞周期蛋白D1的表达量下降,引起更多的细胞停止在G0/G1期.
2003, 30(3):442-446.
摘要:通过缓冲液浸提、戊二醛固定化红细胞吸附、亲和层析和凝胶过滤等方法,从家蝇蛹中分离纯化出一种对半乳糖专一的凝集素.结果表明,亲和层析后,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测家蝇蛹凝集素(MPL)分子质量为84 ku.SephadexG-200凝胶过滤后,MPL分子质量为86 ku.家蝇蛹凝集素专一性识别D-半乳糖,其血凝活力对热不稳定,不依赖Ca2+,在pH 6~9之间稳定.家蝇蛹凝集素对Escherichia coli, Bacillus subtilis和Salmonella typhi有抑制作用.
2003, 30(3):446-446.
摘要:
2003, 30(3):447-452.
摘要:从成人肝脏cDNA文库中,PCR扩增得到人vasostatin基因编码区序列,将此序列插入原核表达载体pQE30进行表达,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定表明产物以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白量的50%以上.包涵体洗涤后溶于8 mol/L尿素溶液,在变性条件下通过镍-氨三乙酸(Ni-NTA)金属螯合亲和层析柱进行纯化后,再经透析进行复性.N端氨基酸序列、分子质量、等电点等理化指标的测定结果与理论值相符.用内皮细胞增殖试验、内皮细胞迁移试验以及鸡胚尿囊膜血管生成试验等方法进行活性检测,证实复性的表达产物具有抑制内皮细胞增殖和迁移、抑制鸡胚尿囊膜血管生成的功能.
谢江碧 , 郭振泉 , 翁宁 , 王洪涛 , 江冠群 , 茹炳根
2003, 30(3):453-460.
摘要:通过多级柱层析,从赤子爱胜蚓抽提物(一组抗肿瘤活性蛋白成分)中纯化得到凋亡相关丝氨酸蛋白酶1(apoptosis-related serine protease 1, ARSP1),SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测得其表观分子质量为28 ku.ARSP1非变性PAGE图谱为相连的多条带,质谱图为多头峰,MALDI-TOF-MS测得各主峰相对分子质量为24 645,25 052和25 281,等电聚焦电泳测得等电点pI<3.8.测得ARSP1 N端25个氨基酸序列为:I(V)IGGT(S)N(D)ASPGEFPWQLSQTRGGSHS,N端序列比较结果显示其与丝氨酸蛋白酶类高度同源.体外实验中,不仅通过凋亡细胞的相差显微观察验证了ARSP1的细胞杀伤活性,而且进一步通过荧光抗体技术对其直接杀伤细胞活性进行了定位研究.Schiff's试剂糖蛋白染色法鉴定ARSP1为糖蛋白(或糖肽),纤维蛋白平板法测得ARSP1同时具有纤溶酶和纤溶酶原激活酶活性,进一步通过苯甲磺酰氟(PMSF)对其纤溶酶活性的抑制实验,证明属于丝氨酸蛋白酶类.
2003, 30(3):461-465.
摘要:猪心移植是解决心脏移植供体少的有效方法.由于猪心血管内皮细胞表面抗原半乳糖-α-1,3-半乳糖(Gal-α-1,3-Gal),能与人体内预存的天然抗体结合产生超急性排斥反应(HAR),而无法应用于临床.为了解决这一难题, 应用噬菌体展示技术,筛选出一个能与抗B型血单克隆抗体(mAB anti-B) 特异性结合的阳性噬菌体克隆,应用酶联免疫吸附测定(ELISA)和竞争性ELISA结果表明,所获得的阳性噬菌体克隆能特异性地与mAB anti-B结合,并且这种结合可被蜜二糖(具有Gal-α-1,6-Glc的结构)所竞争抑制.由此推测,筛选到的噬菌体阳性克隆很可能就结合在蜜二糖与mAB anti-B结合的位点.同时,进行了阳性噬菌体克隆的抑制猪红细胞凝集活性试验,试验结果表明,此阳性克隆不仅可抑制Gal-α-1,3-Gal与抗体的结合, 也可抑制Gal-α-1,3-Gal与西非单叶豆凝集素(GS-I-B4)的结合.此噬菌体阳性克隆测序后,得小肽序列为CCWLLRQPVRFVRSIRS.鉴于以上的结果,认为此小肽可以作为Gal-α-1,3-Gal的模拟肽,同时有望开发成抗猪器官异种移植超急性排斥反应的新药.
赵锦荣 , 白玉杰 , 王胜春 , 郭晏海 , 张庆华 , 张菊 , 阎小君
2003, 30(3):466-470.
摘要:为建立基于TaqMan-MGB探针的沙眼衣原体DNA荧光定量PCR检测方法,探讨其临床应用价值,用 PCR法扩增沙眼衣原体隐蔽质粒pLVG440 2 464~2 980 nt段,并克隆入pMD18-T载体用作参比模板,设计一对引物和一个TaqMan-MGB探针,优化反应条件,建立沙眼衣原体DNA荧光定量PCR检测系统,并运用该系统同时应用连接酶链式反应(LCR)法对临床标本进行检测.结果显示所建立的沙眼衣原体DNA荧光定量PCR检测系统,最低检测限度为1 DNA拷贝每反应;在100~109 DNA拷贝每反应范围内,Ct值(每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数)和DNA拷贝数呈线性关系(r>0.990);对临床标本检测结果同LCR分析结果吻合率为100%.以上结果表明,所建立的基于TaqMan-MGB探针的沙眼衣原体DNA荧光定量PCR检测系统具有敏感性高、特异性强和线性检测范围广等特点,适用于对沙眼衣原体进行大规模筛选.
2003, 30(3):471-473.
摘要:在凝胶介质中结晶了极端嗜酸热菌Sulfolobus shibatae DNA结合蛋白Ssh10b,与没有凝胶介质的条件下相比,晶体的出晶速度减缓,晶体的外形变得更规则,晶胞的C轴变短,晶体衍射分辨率从0.65 nm提高到了0.35 nm.
2003, 30(3):474-477.
摘要:为了建立一种适于实验室乃至常规定量检测mRNA表达的、可快速构建cRNA标准曲线的方法,设计带有T7启动子序列和PolyT序列的引物对目的基因和内参照进行PCR,克隆入载体作为体外合成cRNA的模板,快速构建cRNA标准.结果表明:该曲线的线性范围至少达6个数量级,相关系数为0.99.该法快速、简便,适用于所有靶基因.
李改丽 , 王百忍 , 费玲玲 , 张萍 , 杨浩 , 鞠躬
2003, 30(3):478-482.
摘要:环氧合酶-2(COX-2)是一种具有多种功能的神经调节物质,它的许多功能细节仍不十分清楚,还需要进一步深入研究.用PCR技术从大鼠脑cDNA文库中,扩增到正常成年大鼠COX-2的cDNA序列,测序结果与已发表的序列一致.通过PCR扩增和基因重组,分别构建COX-2编码基因全长和羧基端部分编码序列的表达载体,并导入大肠杆菌DH5α中,通过IPTG诱导表达重组融合蛋白,结果导入全长编码基因表达载体的DH5α无COX-2融合蛋白表达,而羧基端部分基因编码的COX-2融合蛋白在DH5α中以包涵体的形式进行表达.经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,在相对分子质量(Mr)为44 000处有1条特异的蛋白质条带.对以包涵体形式表达的蛋白质进行变性、重折叠及纯化后,得到了高纯度融合蛋白.以重组融合蛋白免疫新西兰种大白兔,制作了抗COX-2多克隆抗体,经酶联免疫吸附测定、蛋白质印迹和免疫细胞化学方法检测,此抗体具有较高效价和特异性.COX-2基因和多克隆抗体的获得,为进一步研究COX-2的功能创造了条件.
张强哲 , 秦曦明 , 梁荣 , 邓明俊 , 何宏轩 , 张彦明 , 郑昌学 , 段明星
2003, 30(3):483-487.
摘要:血凝素蛋白(HA)基因是禽流感病毒(AIV)重要的保护性抗原基因.为了研究 HA基因疫苗,用PCR扩增H5亚型AIV HA基因,将其克隆到质粒pcDNA4/HisMax和pRc/CMV上得到真核表达质粒pC4H5和pCMVH5.采用TfxTM-20、Superfect转染试剂和电转染法转染HeLa细胞,转染后的HeLa细胞经蛋白质印迹和血凝试验检测HA蛋白及其活性.结果表明,Superfect转染和电转染均能正确表达HA蛋白并具有生物学活性,蛋白质印迹检测到HA和HA裂解的HA1和HA2,与AIV 的HA、HA1、HA2蛋白的分子质量一致.从血凝试验结果看,Superfect和电转染表达的HA均具有血凝活性,而经Superfect转染的pC4H5的表达量是pCMVH5的8倍,表明pC4H5是一高效的真核表达质粒.
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