摘要:

摘要:丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 家族广泛存在于高等生物中，介导多种生物学进程，在固有免疫防御中发挥重要作用，是真核细胞抵御病原菌侵染的第一道防线. 越来越多的研究发现，病原菌可以利用多种方式激活或者抑制MAPK信号通路来增强其自身侵染力. 简单介绍了MAPK信号通路的背景并详细总结了近几年关于病原菌如何作用于MAPK信号通路的研究工作，希望以此能够拓展对病原菌与宿主细胞作用方式的认识，深化对MAPK重要作用的了解.

摘要:Geminin是一种定位于核内的多功能小分子蛋白，具有相对复杂的结构模式，在细胞增殖、胚胎发育及肿瘤发生等多方面均发挥重要作用. 它通过调节细胞周期时相中的重要事件作用于细胞增殖：经多种途径参与DNA复制的调节；抑制中心体重复复制；推进G2/M期和维持正常胞质分裂等. 在不同发育阶段，Geminin可作为抑制因子或是诱导因子参与胚胎发育的调节，特别是在神经形成方面.通过与同源异型盒基因或蛋白Six3及Hox等的相互作用，Geminin分别在眼睛发育及胚胎发育过程中起调节作用，并且表现出在细胞增殖与分化中协调因子的功能. 近年来Geminin在肿瘤中的作用已成为研究的重点，它可作为评价肿瘤发生进程和预后的标志分子，并可望是一个新的肿瘤治疗的作用靶点. 对Geminin活性的调节主要表现在转录水平和转录后水平，转录后水平的调节可能占主要地位.

摘要:粘附分子通过介导细胞间相互作用发挥其在发育、再生和突触修饰等方面的重要作用.神经细胞粘附分子CHL1(close homologue of L1)是近年发现的粘附分子，属于粘附分子免疫球蛋白超家族，集中表达于神经系统，通过亲异性作用(heterophilic interaction) 介导细胞与细胞、细胞与胞外基质的相互作用，进而参与神经系统的发育、轴突的生长、迁移及导向等过程.

摘要:DNA损伤应激反应是维持基因组稳定性的基石. 细胞在长期进化中形成了由损伤监视、周期调控、损伤修复、凋亡诱导等在内的自稳平衡机制. 一方面，借助感应、识别并启动精细而复杂的修复机制修复损伤；另一方面，通过DNA损伤应激活化的细胞周期检查点机制，延迟或阻断细胞周期进程，为损伤修复提供时间，使细胞能安全进入新一轮细胞周期；损伤无法修复时则诱导细胞凋亡. DNA双链断裂 (double strand breaks，DSBs) 是真核基因组后果最严重的损伤类型之一，其修复不利，同肿瘤等人类疾病的发生发展密切相关. 新进展揭示：DSBs损伤反应信号分子ATM-Chk2-p53、H2AX等的组成性活化，是肿瘤形成早期所激活的细胞内可诱导的抗癌屏障，其信号网络的精确、精细调控在基因组稳定性维持中发挥重要作用. 此外，HIV病毒整合进入宿主细胞基因组的过程也依赖于宿主细胞中ATM介导的DSBs损伤反应信号转导；ATM特异性的小分子抑制剂在抗HIV感染中显示重要的功能意义. 文中重点讨论调控DSBs损伤应激反应信号网络的主要研究进展，及其在肿瘤发生、发展及抗HIV感染中的新医学意义.

摘要:河豚毒-抵抗性(TTX-R) Nav1.5 Na⁺通道是心肌的特异性Na⁺通道，虽然研究发现神经元中也存在河豚毒-抵抗性Na⁺电流及Nav1.5/SCN5A mRNA的表达，但其确切的cDNA序列尚不清楚. 采用RT-PCR法对人脑组织Nav1.5/SCN5A基因cDNA进行克隆发现：人脑组织Nav1.5/SCN5A基因cDNA有2种变构体，hB1和hB2 (accession number EF629346，EF629347)，其中hB1全长6 201个碱基，其开放读码框架(ORF)参与编码2 016个氨基酸，和人心肌Nav1.5 Na⁺通道氨基酸序列相同率高达98%，共有28个不同的氨基酸，其中7个集中位于第6A外显子与第6外显子编码区. 与人心肌Nav1.5/SCN5A基因cDNA不同的是，在对人脑组织Nav1.5/SCN5A基因cDNA的克隆中未发现该基因第18外显子的选择性剪接，但却发现其第24外显子的选择性剪接，2种选择性剪接体 (hB1和hB2) 在脑组织中基本同时表达，表达比率接近 1∶1，但在心脏中二者的表达比率却与年龄有关. 人Nav1.5/SCN5A基因的第24外显子定位于染色体3P21区，共有54个碱基，参与编码18个氨基酸. RT-PCR法证实第24外显子的选择性剪接也可发生在大鼠心脑之外的其他组织中，竞争性PCR法证明，不同组织中2种选择性剪接体的表达比率不同，且随着周龄的增加，2种选择性剪接体在各组织中表达的变化趋势不同. 此外，RT-PCR法还发现Wistar大鼠全身16种组织中均可检测到Nav1.5/SCN5AmRNA的表达. 上述实验结果说明，Nav1.5 Na⁺通道在全身组织中分布广泛，但编码人脑组织Nav1.5 Na⁺通道与心肌组织该离子通道的cDNA序列不同，是Nav1.5/SCN5A基因的2种变构体，这为深入研究不同组织中Nav1.5 Na⁺通道的功能提供了基础.

摘要:tau蛋白是中枢神经系统中重要的微管相关蛋白，其功能受磷酸化调节. 异常过度磷酸化的tau蛋白是阿尔茨海默病患者脑中神经纤维缠结的主要组成部分. 糖元合成酶激酶3β (glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β) 是重要的tau蛋白激酶之一，它虽可催化tau蛋白多个位点的磷酸化，但对不同位点，其催化效率不同. 通过位点特异性、磷酸化依赖的tau蛋白抗体，用免疫印迹技术，检测GSK-3β对tau蛋白位点特异性的磷酸化作用及动力学. 用双倒数作图，计算GSK-3β催化tau磷酸化以及各个位点磷酸化的K_m值，并结合培养细胞中的实验，研究GSK-3β对tau蛋白磷酸化作用的位点特异性. 结果显示，GSK-3β催化tau蛋白多个位点的磷酸化，其中包括Thr181、Ser199、Ser202、Thr205、Thr212、Thr217、Thr231、Ser396和Ser404，对不同的位点磷酸化作用，其K_m值不同，GSK-3β对Ser396的Km值最低，即对Ser396位点的亲和性最高，催化其磷酸化的能力最强. 在培养的细胞中，也显示了GSK-3β的表达引起Ser396位点的磷酸化最明显.

摘要:为了研究神经元限制性沉默因子(NRSF)调控神经元及胰岛细胞中神经特异性基因的表达，进一步寻找胰岛细胞中可能存在的其他NRSF调控基因. 先用生物信息学手段对相关基因进行了分析. 筛选及序列比对发现，人胰岛素核心启动子区有一段与NRSE相似的序列，提示，它可能受NRSF调控.构建了含NRSF基因的慢病毒载体，将其稳定转染于INS-1细胞. 构建了3种荧光素酶报告载体：含有人胰岛素启动子-荧光素酶 (hInsP-LUC) 的慢病毒载体，pGL3-Basic载体和含有2拷贝NRSE样基序-荧光素酶 (NRSE-LUC) 的报告载体. 利用稳定转染及瞬时转染实验观察NRSF对报告载体中荧光素酶活性的影响. 利用电泳迁移率变动分析实验观察NRSE样基序与NRSF蛋白的结合情况，并通过竞争结合实验、引入特异性抗体实验证实探针与蛋白质结合的特异性. RT-PCR检测证实，感染空病毒的INS-1细胞不表达NRSF，感染含目的基因慢病毒的INS-1细胞能表达NRSF. 将含有hInsP-LUC的慢病毒载体稳定转染于上述2种细胞，荧光素酶活性分析结果显示，NRSF的过表达能明显降低胰岛素启动子的活性. 瞬时转染hInsP-LUC报告系统于上述2种细胞，结果也显示NRSF能明显抑制胰岛素启动子-荧光素酶的活性. 将含有NRSE-LUC的报告载体瞬时转染于上述2种细胞，结果表明过表达NRSF的INS-1细胞组的荧光素酶相对值比对照组有明显下降. 电泳迁移率变动分析实验进一步证实，此NRSE样序列可以与NRSF蛋白特异结合，这种特异结合可以被标准的NRSE序列所竞争. 结果表明，人胰岛素启动子中含有NRSE样序列，该序列通过与NRSF蛋白结合从而抑制人胰岛素启动子的转录活性. 这一研究工作有助于进一步了解NRSF在胰岛细胞中的调控作用.

摘要:脱水素在胚胎发育后期累积，外源脱落酸(ABA)、低温、干旱和其他一些环境条件下能诱导脱水素的产生，尽管植物在脱水条件下脱水素广泛存在于细胞中，但其生化功能仍不清楚. 为研究小麦在不同时期脱水素基因的表达情况和生物学功能及抗体制备，以小麦幼芽为材料，经干旱胁迫处理后，提取总RNA，通过RT-PCR得到小麦类脱水素基因片段(WZY1-1)，再连接至克隆载体PUC_M-T，并成功构建重组表达质粒PET-32a(+)-wzy1-1，将阳性重组质粒转化于受体菌BL21(DE3)感受态细胞中，经IPTG诱导表达，进行表达产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测. 结果表明，表达蛋白位于37 ku处，小麦类脱水素基因获得高效表达. 表达蛋白经Ni²⁺琼脂糖凝胶亲和层析和透析袋电洗脱法纯化后，对兔子进行免疫，制备的抗血清通过ELISA检测到较高的多克隆抗体效价. 蛋白质印迹结果显示，利用纯化的蛋白质制备的兔抗血清可以很好地和所表达的蛋白质带特异性结合，且郑引1号小麦幼苗进行干旱处理，提取粗蛋白，SDS-PAGE，蛋白质印迹检测显示，在分子质量28 ku处出现特异的蛋白质条带，这说明所制备的抗血清可以与小麦叶片所表达的dehydrin蛋白特异性结合，证明其具有良好的免疫原性.

摘要:整合酶作用的病毒DNA整合进宿主DNA的过程是反转录病毒在宿主细胞中增殖的关键步骤. 由于在正常人类细胞中不存在相似的功能蛋白，其抑制剂对人体的副作用可能很小，相对于经典AIDS治疗药物的毒副作用，整合酶抑制剂理论上要具有优势. 在线性七肽库中筛选与整合酶有特异结合作用的噬菌体展示肽，选取TPSHSSR和HPERATL 2条肽，它们可以竞争性地抑制展示相应肽段的噬菌体与整合酶的结合，同时它们对整合酶的整合活性也有一定程度的抑制，半数抑制率分别为IC₅₀=(54.56 ± 5.18) μmol/L，IC₅₀=(28.29 ± 1.32) μmol/L. 这些多肽可用于治疗艾滋病新药的开发应用及整合酶结构及作用机制的研究.

摘要:以猪流行性腹泻病毒 (porcine epidemic diarrhea virus，PEDV) S 基因的免疫优势区S1 (1～2 367 bp) 为靶基因，利用基于gⅢ表达外源多肽的fd丝状噬菌体展示系统，构建S1基因噬菌体展示肽库，以纯化病毒制备的兔抗PEDV多克隆血清为靶蛋白，对S1基因噬菌体展示肽库进行3轮生物淘选，结果获得3个高亲和力的序列，分别命名为S1P1(248～280位氨基酸)、S1P2 (442～499位氨基酸) 和S1P3 (697～742位氨基酸). ELISA和蛋白质印迹结果显示，S1P1、S1P2和S1P3短肽都能被兔抗PEDV多克隆血清识别，其中S1P3反应性最强. 为了进一步揭示S1P1、S1P2和S1P3短肽的抗原性，制备了3个短肽GST融合蛋白和它们串连后GST融合蛋白的单因子血清，间接免疫荧光试验 (IFA) 结果证实，抗S1P2-GST、S1P3-GST和S1P123-GST融合蛋白的单因子血清能够识别Vero细胞培养物中天然的PEDV.

摘要:钙离子作为广泛存在的细胞内信使物质，在动物胚胎早期发育过程中扮演重要角色. 为了研究钙离子在斑马鱼胚胎发育过程中的空间分布和浓度变化，采用Fluo-4和 Indo-1作为钙离子指示剂，利用激光共聚焦和双波长荧光比例成像技术，对斑马鱼胚胎第一次卵裂过程中的钙信号进行了详细的跟踪观察. 在第一次卵裂过程中，斑马鱼胚胎的动物极顶端首先出现高钙斑，然后在分裂沟部位出现高浓度的钙信号，这一信号在卵裂过程中持续存在. 利用Indo-1双波长荧光比例成像对上述过程中钙离子的时空分布进行了定量测定，表明，胞内钙离子在卵裂开始之前是均匀分布的，随着分裂沟的出现，其附近区域的钙浓度显著升高，而胞内其他区域的钙浓度则保持不变. 双波长荧光比例成像排除了荧光染料分布不均匀造成的干扰，为钙信号与胚胎分裂的密切关系提供了确凿的定量依据.

摘要:为构建人源蛋白酶体α亚基6 (α6) 的酵母展示体系，研制其单克隆抗体用于抗体表位分析和研究泛素-蛋白酶体途径，建立绕过重组抗原表达及纯化制备、将展示重组抗原直接应用于抗体检测的方法. 在酵母展示表达载体pICAS中引入His.tag标签，将编码α6的基因PSA6_HUMAN克隆到酵母表面展示载体pICAS-H上，用流式细胞仪检测其抗原表位活性，以表面展示α6的重组酵母细胞，结合酶联吸附免疫检测技术，建立酵母(yeast)-ELISA检测技术，应用于检测小鼠单克隆抗体及单抗效价. 酵母细胞培养48 h后获得抗原α6的高效表面展示，展示的α6具有良好的抗原活性和特异性，将α6的展示酵母用于yeast-ELISA的初步实验结果显示可有效检测和筛选到抗α6抗体.

摘要:植物核糖体失活蛋白 (ribosome-inactivating protein，RIP) 是一类能作用于核糖体最大RNA的独特蛋白质.它是研究蛋白质生物合成中核糖体RNA结构与功能的有力工具.利用RIP能在DNA中脱去一些腺嘌呤碱基使超螺旋DNA解旋的特点，分别以常用的质粒PUC18、PUC19和PBR322 DNA为底物，建立了测定RIP酶活性的一种新方法，其灵敏度是50 ng (天花粉蛋白) 和5 ng (还原型的辛纳毒蛋白)，酶催化反应的时间是60 min. 这个新方法具有方便、快捷、灵敏的特点，避免了常用方法中制备核糖体、提取RNA的仪器和技术条件的限制，检测的时间由原来的几天缩短到约120 min，大大地降低了检测的费用，为广泛和深入地研究RIP提供了有利的条件.