摘要:今年在墨西哥暴发的流感疫情来源于一种新的流感病毒：甲型H1N1病毒．这种病毒包括人源，禽源和猪源等甲型流感病毒基因片段，为混合毒株．比较了禽、猪和人的流感病毒在其天然宿主中的致病机理，主要目的是评估猪和禽的流感病毒成为人兽共患病的可能性，同时还评估猪在禽流感病毒传入人的过程中可能起到的作用．禽流感和猪流感作为人畜共患疾病，在流感病毒从动物到人的传播过程中起到关键的作用．猪作为流感病毒的中间宿主，具有混合器作用，人、猪、禽流感病毒可在其体内进行基因重排产生新病毒，并可能跨越种间屏障感染人类．但是流感病毒本身的跨越种间障碍传播不足以引起人流感的大暴发，动物流感病毒必须经过显著的遗传变异后才能使其在人群中长期存在．

摘要:乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染早期进入肝细胞机制研究一直是HBV研究领域的热点和难点．简单易得的HBV体外感染细胞模型是HBV感染进入机制研究无法逾越的主要障碍．近年来，随着新型HBV体外感染细胞模型的建立和应用(HepRG细胞和树鼩原代肝细胞)，HBV的进入机制研究取得了一系列重大发现．综述了近几年HBV进入肝细胞机制的最新研究进展，主要包括HBV表面蛋白进入相关结构域的鉴定，已发现的候选HBV进入相关分子和尚待解决的问题．

摘要:双重编码(dual coding)是指一段mRNA序列同方向上存在两个开放阅读框架，从而可编码不同氨基酸序列的现象．双重编码现象在原核生物、噬菌体和病毒中作为一种可有效利用基因组的方式而普遍存在．新近报道，在真核生物中也存在双重编码现象，对于认识真核生物基因表达调控的机制提供了新的信息．

摘要:番茄丛矮病毒的P19蛋白不仅是一个重要的病毒致病因子，而且还可作为RNA干扰(RNAi)的抑制子．这种作用是通过限制细胞内的小RNA，比如小干扰RNA(siRNAs)和微RNA(miRNAs)来实现．但是目前对P19蛋白在哺乳动物细胞上的作用还未见报道．构建了一株p19稳定表达的293细胞系，即293-p19．流式细胞仪分析发现在293细胞中过量表达P19蛋白可显著引发细胞周期的G2/M阻滞．细胞增殖实验显示，293-p19细胞的DNA复制及细胞生长均受到显著的抑制． 此外，研究还发现p19可使人胚肾293细胞内的细胞周期调控子的表达谱发生改变． 其中包括上调cyclin A1，CDK2，CDK4，CDK6，p18，cyclin D2，p19INK4d和E2F1，及下调p15，cyclin A，cyclin B1和cyclin E1的表达．上述研究结果提示，p19有可能靶向多个G2/M调控蛋白从而引发细胞的G2/M阻滞．

摘要:确定沙眼衣原体CT358蛋白在衣原体感染细胞中的位置并初步鉴定其生物学功能．采用PCR方法从D型沙眼衣原体的基因组中扩增CT358基因，并克隆入pGEX和pDSRedC1表达载体中．将重组质粒pGEX-CT358转化到XL1-blue宿主菌，并诱导表达融合蛋白GST-CT358．纯化后的CT358融合蛋白免疫小鼠制备抗体，应用间接免疫荧光技术对CT358蛋白在衣原体感染细胞内的定位及表达模式进行分析．同时，pDSRedC1-CT358重组质粒瞬时转染HeLa细胞，观察CT358蛋白对衣原体感染的影响．实验结果证明CT358蛋白为沙眼衣原体包涵体膜蛋白．该蛋白质在衣原体感染12 h后就表达定位于包涵体膜上，直至持续到整个感染周期，转基因在胞浆表达的CT358融合蛋白不影响其后的衣原体感染．该研究为深入研究衣原体与宿主细胞间相互作用提供了新的线索，并可为衣原体性的治疗、预防提供新方向．

摘要:农杆菌已经用作许多生物过程研究的模型细菌，为了解析这些生物过程的分子机理，对农杆菌的某些基因进行突变就显得非常重要．以自杀性基因sacB作为反向可选择性标记基因，利用同源重组的原理，建立了一种可对农杆菌基因进行准确插入、删除和位点置换的突变方法，所获突变体不带任何不需要的外源DNA序列．通过详细研究同源序列的长度对农杆菌同源重组效率和突变体产生概率的影响，以及对农杆菌中的同源重组机理的分析，提出了优化该突变体产生方法的方案，即通过设计不等长的上下游同源序列和选择其中一种类型的单交换重组体来筛选二次交换重组体的方法，可以显著地提高理想突变体的产生概率．研究结果对如何提高突变体的产生概率和减少突变体筛选的工作量具重要的参考价值．利用该方法成功地获得了两个基因被同时删除而且不含抗性标记的农杆菌突变株．

摘要:根据表型性状选取少量辽宁绒山羊个体，直接进行类胰岛素生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ) 基因5′调控区克隆测序以确定单核苷酸多态(SNP)位点，共发现4个SNPs，分别是G→C (388 bp)、A→G (668 bp)、A→C (719 bp)、G→A (752 bp)的突变，导致5′调控区305～800 bp中比野生型个体减少一个CdxA转录因子结合位点，但C/EBP的值 (89.2)高于野生型 (88.5)．然后通过引入错配碱基创造酶切位点技术和多聚酶链反应-限制性片段长度多态性 (PCR-RFLP)方法，对520只辽宁绒山羊进行基因型检测，结果表明，每个SNP位点在本群体中都有AA (野生型)、AB和BB (突变型) 三种基因型，且4个SNPs位点共有13种单倍型组合．将不同SNP的基因型及单倍型组合与绒产量、绒纤维细度和绒纤维长度进行关联分析发现，SNP2位点的AA基因型绒纤维细度极显著低于AB型和BB型 (P < 0.01)，而SNP4位点AA基因型产绒量显著高于AB型和BB型 (P < 0.05)，单倍型组合H7H7与产绒量和绒纤维细度均有显著相关(P < 0.05)．IGF-Ⅰ基因可能是影响绒山羊产绒性状的主要候选基因．

摘要:慢性骨髓炎因其病程漫长、易出现并发症以及复发率高成为临床上棘手的难题，其主要致病原因是金黄色葡萄球菌等革兰氏阴性菌感染．脂多糖(LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁的重要成分，用LPS在体外刺激骨组织相关细胞在一定程度上可以模拟骨髓炎患者的病理特征．实时荧光定量PCR和Western blot等试验结果表明，在骨髓炎患者的骨组织和LPS刺激的成骨细胞中，几丁质酶家族成员CHI3L1的表达均有明显升高．核因子κB (NF-κB) 萤光素酶报告载体检测结果显示，LPS能诱导细胞的NF-κB活化，NF-κB活化抑制剂Bay11-7082能抑制LPS诱导的CHI3L1表达升高．用抗肿瘤坏死因子α(TNF-α)的抗体预处理细胞，或采用siRNA干扰的方法抑制TNF-α受体的表达，都能明显抑制LPS诱导的CHI3L1表达上调．同时，NF-κB活化抑制剂Bay11-7082预处理细胞能抑制LPS对TNF-α表达的诱导作用．结果提示，LPS通过激活NF-κB诱导TNF-α分泌上调，刺激CHI3L1表达．提出骨髓炎及脂多糖刺激条件下CHI3L1表达上调，并在细胞水平上初步探讨了脂多糖诱导CHI3L1表达的分子机制．

摘要:为了探讨EB病毒潜伏性膜蛋白 1(LMP1)第三个功能活性区域(CTAR₃)在鼻咽上皮细胞NP69中的转化作用机制，采用逆病毒感染的方法，将浓缩的逆病毒RV-LMP1和RV-LMP1^Δ232～351分别感染鼻咽上皮细胞NP69，建立NP69-LMP1与NP69-LMP1^Δ232～351稳定表达细胞系．通过绘制生长曲线、平皿克隆形成试验和软琼脂集落形成试验比较野生型和突变型LMP1对NP69细胞增殖的影响，运用蛋白质组学方法鉴定NP69-LMP1与NP69-LMP1^Δ232～351细胞间的差异表达蛋白，选用实时荧光定量RT-PCR与Western blot对其中部分蛋白质点差异表达进行验证．结果发现：a．突变型LMP1^Δ232～351促NP69细胞增殖的能力较野生型LMP1明显降低(n=3，P < 0.05)；b．鉴定了LMP1-CTAR₃在NP69细胞中参与调节的16个蛋白质(表达上调的蛋白质8个，下调的8个)．c．实时荧光定量RT-PCR和Western blot证实了部分上述蛋白质的差异表达．以上结果说明，LMP1-CTAR₃是其发挥促细胞增殖的重要活性部位，可能通过参与调节G蛋白和异柠檬酸脱氢酶等蛋白质的表达而起作用．

摘要:视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)中由于Rb基因缺失或失活，转录调控因子E2F1始终处于活化状态，细胞不断增殖，E2F1活性增加是恶性肿瘤的普遍现象．根据人E2F1基因设计了3段shRNA，构建RNA干扰表达载体pSilencer-shE2F1，瞬时转染人视网膜母细胞瘤细胞株HXO-Rb-44和人肝癌细胞株SMMC-7721，通过荧光定量PCR检测E2F1表达水平的变化，PI (碘化丙锭)染色检测细胞周期各时相细胞数量以检测其对细胞周期的影响．根据筛选出的有效shRNA序列构建腺病毒载体并包装出腺病毒Ad-shE2F1，在裸鼠前房模型中，体外按50 moi的感染系数感染稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)的人视网膜母细胞瘤细胞株48 h后，收集细胞，将2×10⁵细胞注射到裸鼠眼前房内，连续观察眼内肿瘤细胞生长情况并拍照记录．通过转染肿瘤细胞株检测E2F1转录水平，筛选到1个能明显抑制肿瘤细胞内E2F1表达的shRNA序列，并使细胞周期中S期细胞数减少．经Ad-shE2F1感染的RB肿瘤细胞与对照相比较，其在裸鼠眼前房内肿瘤生长减缓．结果说明，有效抑制hE2F1表达的shRNA具有抑制体内外人视网膜母细胞瘤生长的作用．

摘要:二酮酸类化合物(DKAs)是目前最有前景的HIV-1整合酶(integrase, IN)抑制剂．为了解DKAs引起的多种耐药株共有的耐药性机理，选择3种S-1360引起的IN耐药突变体，用分子对接和分子动力学模拟，研究了野生型和突变型IN与S-1360的结合模式，基于该结合模式探讨了3种耐药突变体所共有的耐药性机理．结果表明：在突变体中，S-1360结合到耐药突变IN核心区中的位置靠近功能loop 3区却远离与 DNA结合的关键残基，结合位置不同导致S-1360的抑制作用部分丧失；残基138到166区域的柔性对IN发挥生物学功能很重要，S-1360能与DNA结合的关键残基N155及K159形成氢键，这2个氢键作用降低了该区域的柔性，突变体中无类似氢键，因而该区域柔性增高；在突变体中，S-1360的苯环远离病毒DNA结合区，不能阻止病毒DNA末端暴露给宿主DNA；T66I突变导致残基Ⅰ的长侧链占据IN的活性口袋，阻止抑制剂以与野生型中相同的方式结合到活性中心，这均是产生抗药性的重要原因．这些模拟结果与实验结果吻合，可为抗IN的抑制剂设计和改造提供帮助．

摘要:组织因子是一种位于细胞膜上的糖蛋白，是外源性凝血过程的关键启动因子，近年来其在肿瘤细胞迁移等其他过程中的重要作用也已逐渐被揭示．构建了融合有His标签的小鼠组织因子胞外区段重组蛋白基因，利用昆虫杆状病毒蛋白表达系统成功表达并得到大量可溶性重组小鼠组织因子．利用血浆凝集实验和鼠尾流血时间实验对此重组小鼠组织因子进行的活性检测表明，此重组蛋白具有良好的生物活性，可以引起血浆凝血或缩短鼠尾流血时间．同时，利用此重组蛋白为抗原，制备了小鼠组织因子的小鼠源功能阻断性单克隆抗体，在血浆凝集实验中证明其对小鼠组织因子的活性有明显抑制作用．利用此阻断性单抗，成功地在小鼠深静脉血栓模型中减轻了血栓形成，证明组织因子在深静脉血栓的病程发展中起重要作用，这也是组织因子阻断性单抗在此类动物模型中的首次成功应用．通过此项工作，成功地建立了大量制备具有良好生物活性的重组小鼠组织因子蛋白的方法，并进而得到了小鼠组织因子功能阻断性单抗，为利用各种小鼠动物模型对组织因子在各项生命活动中的作用进行深入研究奠定了良好的基础．

摘要:miRNAs通过完全或不完全的碱基互补绑定到信使RNA(mRNA)上，通过抑制翻译或者直接导致mRNA降解的方式来调节靶基因的表达．为了研究miRNAs在转录水平上面的调控作用，两种人类基因组中组织特异的miRNAs(miR-1和miR-124)被转染到HeLa细胞中，微阵列(microarray)分析转染前后细胞中各基因mRNA表达水平变化情况的结果表明：动物基因组中靶基因与miRNAs不完全的碱基互补也会导致mRNA的直接降解．通过分析实验得到的mRNA表达水平变化数据，发现这相同miRNA的不同靶基因mRNA表达水平的下调倍数有着明显的差别，推测这些靶基因mRNA序列本身存在某些影响其受调节程度的因素．为此，提取和分析这些靶基因mRNA的序列特征，通过对这些序列特征与mRNA表达水平下调数据进行统计相关分析，最终发现，miRNA靶基因受调节的程度与以下几个因素相关联：mRNA序列中miRNA靶位点的个数，靶位点与miRNA序列碱基互补的程度，以及绑定后形成二级结构的稳定程度(即最低自由能的大小)．在此基础上，初步建立起一个多因子作用下的miRNA 靶基因mRNA表达水平下调程度模型，分析表明：该模型在一定程度上可以反映了部分序列特征对于miRNA靶基因mRNA表达水平下调程度的影响．

摘要:利用高通量组织微阵列结合免疫组化检测MT1-MMP、MT2-MMP、Ezrin、nm23-H1、E-cad和TIMP-2在鼻咽癌组织中的蛋白质表达，探讨肿瘤转移相关基因异常表达在鼻咽癌侵袭转移中的作用，筛选鼻咽癌转移相关分子标志物．结果发现，鼻咽癌组织存在MT1-MMP、Ezrin蛋白高表达(P < 0.01)和 nm23-H1、TIMP-2蛋白低表达(P < 0.05)．临床Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期鼻咽癌和淋巴结转移鼻咽癌中MT1-MMP 、MT2-MMP和 Ezrin蛋白阳性表达显著高于临床Ⅰ期鼻咽癌和无转移癌(P < 0.05，P < 0.01)，但临床Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期鼻咽癌和淋巴结转移鼻咽癌中nm23-H1蛋白的阳性表达显著低于临床Ⅰ期鼻咽癌和无转移癌(P < 0.05)．鼻咽癌组织中MT1-MMP与MT2-MMP ( r = 0.308, P < 0.001), nm23-H1与E-cad( r = 0.167, P < 0.05)及TIMP-2( r = 0.279, P = 0.001)，E-cad与TIMP-2( r = 0.279, P = 0.001)的蛋白质表达呈显著正相关．MT1-MMP与E-cad (r = -0.188, P < 0.05)及TIMP-2(r = -0.233, P < 0.05)，Ezrin与 E-cad( r = -0.204, P < 0.05)的蛋白质表达呈显著性负相关．聚类分析显示，鼻咽癌MT1-MMP、MT2-MMP和Ezrin蛋白共同阳性表达显著高于慢性炎性鼻咽上皮(P < 0.05)，但nm23-H1、E-cad和TIMP-2蛋白在鼻咽癌组织中的共同阴性显著高于癌旁上皮和慢性炎性鼻咽上皮(P < 0.05, P < 0.01)．多因素分析和有效性评估发现，MT1-MMP蛋白能较好地独立预测鼻咽癌淋巴结转移和临床进展．上述研究结果提示，多个肿瘤转移基因的蛋白质高表达，转移抑制基因的低表达和这些基因的蛋白质表达失平衡在鼻咽癌淋巴结转移和临床进展过程中起重要作用．MT1-MMP蛋白可作为预测鼻咽癌淋巴结转移的较好分子标志．

摘要:微环境在促进干细胞分化过程中起着重要的作用，研究心肌样微环境介导脂肪干细胞向心肌细胞分化有重要意义．将脂肪干细胞与心肌细胞直接或通过细胞培养小室间接共培养，检测脂肪干细胞的分化情况．对于直接共培养体系，采用绿色荧光蛋白CFSE对脂肪干细胞进行标记，然后与心肌细胞以1∶5混合后进行直接共培养，2周后，通过流式细胞仪分选分化的脂肪干细胞，并检测其分化情况．检测方法包括：扫描电镜和透射电镜观察细胞的超微结构；免疫细胞化学检测心肌特异性肌球蛋白重链(MHC)、肌钙蛋白(TnⅠ)和连接蛋白(Cx43)；Western blot定量分析；RT-PCR检测心脏特异性转录因子mRNA的表达．结果表明，分化的脂肪干细胞呈现心肌样超微结构，并表达心肌特异性蛋白和转录因子，并且直接共培养体系中分化的脂肪干细胞其表达率明显高于间接共培养体系中的表达率．因此，在心肌样微环境中，除了可溶性细胞因子对分化起作用以外，心肌细胞产生的机械牵拉对脂肪干细胞向心肌细胞分化也起着重要的作用．

摘要:LCRG1基因( laryngeal carcinoma related gene1，LCRG1 )是一个新的喉癌候选抑瘤基因，其转录调控机制一直未被阐明．通过限制性内切酶酶切介导对LCRG1基因 (-169～+127)区域进行剪切体分析，将LCRG1基因最小启动子定位于-169～-57．应用连接体扫描突变体分析，将关键顺式作用元件确定在-137～-122．生物信息学提示该区存在SP1、E2F1/DP1、EKLF和ZF9转录因子结合位点．利用已知反式作用因子与报告基因质粒进行共转染，提示Spl为有效的反式作用因子，且能上调LCRG1基因的表达．凝胶迁移阻滞实验确定LCRG1基因关键的顺式作用元件区域具有Spl结合位点．LCRG1基因启动子-137～-122片段在该基因表达过程中可能起重要作用，为LCRG1基因功能研究提供了新的证据．

摘要:大脑神经元胞外单细胞动作电位(即锋电位)的检测和分类是提取神经元脉冲序列、研究神经系统信息处理机制的关键．为了提高锋电位的检出率和分类的正确性，设计了一种处理多通道锋电位记录信号的算法，用于分析微电极阵列记录的大鼠海马神经元锋电位信号，电极阵列上的测量点排列紧密，4个通道可以同时记录到来自相同神经元的信号．该算法首先利用一种多通道阈值检测法检出四通道记录信号中的锋电位，然后利用一种基于复合锋电位的主成分特征参数分类法将锋电位分类．仿真数据和实验记录信号的检验结果表明：与相应的单通道算法相比，该算法的锋电位检出率和分类的正确性显著提高，并且可以增加单次实验测得的神经元数目．因此，该算法为实现神经元锋电位的自动检测提供了一种简单有效的新 方法．

摘要:秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)是研究动物遗传、个体发育和行为活动的重要模式生物，其主要优点是能够研究从分子细胞水平到整体系统水平的相关生命活动的作用机理．其中基因显微注射和整合是该领域的核心技术，广泛应用于研究线虫的基因表达、功能和基因间的相互作用等．显微注射技术使用尖端开口直径为微米级的玻璃微管，将所研究的目的DNA注射进线虫的性腺．注射的DNA被成熟的卵细胞吸收，以染色体外遗传物质的形式存在．但这种形式并不能稳定遗传，可采用基因整合技术将外源基因整合到染色体上，得到稳定遗传的线虫种系．显微注射是一项精细的实验技术，影响实验成功与否的因素较多，实际操作需要有一定的经验．在实践过程中逐步改进和完善了这项技术，在此主要介绍线虫显微注射技术的操作过程、创新方法以及注意细节．