1 材料与方法
1.1 实验材料
分子实验相关试剂无特殊说明均购于Takara公司，细胞培养相关试剂无特殊说明均为Gibco公司产品，化学试剂无特殊说明均购自Sigma公司. 实验猪均来自中国科学院广州生物医药与健康研究院医用猪大动物基地，所用细胞均由中国科学院广州生物医药与健康研究院赖良学实验室自行分离冻存. 所用卵均从广州市屠宰场取回后由本实验室体外培养成熟. 所有动物的饲养管理和使用都符合公共卫生服务条例，动物福利法规以及中国科学院广州生物医药与健康研究院关于保护和使用实验动物的相关政策（国际AAALAC标准）. 所有的动物实验均按照实验动物使用操作规程进行操作. 实验动物饲养和使用均得到中国科学院广州生物医药与健康研究院实验动物管理委员会和实验动物福利和管理委员会的许可，实验动物许可证：#A5748-01.
1.2 实验方法
1.2.1 Tiki1基因靶位点的选择及gRNA 的制作
a. 靶位点的选择
基因靶位点的选择遵循 GGN(17~18)NGG（N为任意碱基）的序列要求，其中GGN(17~18)是与靶基因结合的位点，NGG是Cas9蛋白切割所必需的PAM（protospacer-adjacent motif）区. 因为我们实验室所用的 pT7-gRNA 体外转录载体是 T7 启动子，所以要求第二位碱基也为 G；若是选择其他启动子则第二位碱基可任意修改. 此外，可在正义链或反义链上选择靶位点.
b. 靶位点退火成含黏性末端的小片段
选择了合适的靶位点之后，根据靶位点合成2条oligo（均为24 nt，S序列与靶序列同向，AS反向）. S引物序列为：5'-CACC-GN19-3'；AS引物序列为：5'-AAAC-GN19-3'(含第一个G,反向互补).
用一个1 L的烧杯装满水，微波炉加热至沸腾后，把配置好的反应液置入烧杯中，继续中火加热10 min，取出大烧杯自然冷却至室温后取出1.5 ml 于EP管瞬时离心备用.
c. 空载体（pT7-gRNA）的线性化
pT7-gRNA 质粒含有2个BbsⅠ酶切位点，经BbsⅠ内切酶酶切成含黏性末端的线性化 gRNA （L-gRNA），在 1.5 ml EP 管中配置反应液混匀后，37℃、4 h，电泳回收L-gRNA 后，用40 μl dd
H2 O溶解.d. L-gRNA与退火靶位点的连接
L-gRNA与退火靶位点的连接用TAKARA公司提供的solutionⅠ，在 PCR 管中配置反应液混匀后，然后16℃，30 min转化，涂氨苄抗性的平板，第2 d后挑取4个菌落扩大培养提取质粒送测序，测序正确的 gRNA 质粒备用.
具体步骤如下：10 μl连接产物+50 μl Top 10 感受态细胞→混匀后，冰上放置30 min→42℃， 90 s→冰上冷却约 3 min→加入500 μl无抗性 LB培养基，37℃摇床中摇30 min→取250 μl涂氨苄平板，过夜培养→挑取单个菌落.
实验室使用的Cas9a质粒（货号41815）购自Addgene官网. 测序正确的gRNA和Cas9质粒大量制备质粒，质粒浓度在1g/L，A260/A280值在1.8左右的质粒方可进行下一步的细胞转染用.
1.2.2 猪胎儿成纤维细胞的分离培养及冻存和复苏
a. 分离培养：本实验用猪胎儿样品取自自然交配，怀孕 35 d的母猪，通过手术将整个子宫取出，置于冰上，带回实验室. 在无菌细胞间条件下，将胎儿从尿囊中剥离出来，放在10 cm培养皿中，用含有抗生素的 PBS 清洗3遍. 在超净工作台上，用灭菌的剪刀将胎儿的内脏、头部和四肢剪掉，PBS再清洗3遍. 将胎儿的躯干转移到新的10 cm培养皿中，用眼科剪将猪胎儿剪碎成非常小的组织块，加入12 ml胶原酶消化液，在37℃细胞培养箱中消化2~3 h. 消化完成后，收集消化液至15 ml离心管中，200 g、离心4 min，去上清，再加入适量培养基重悬，同样条件离心，将胶原酶去除干净. 离心后去除上清，用培养基重悬后接种到新的10 cm培养皿中（一个胎儿3个10 cm培养皿，每个培养皿中加10 ml培养基），37℃、5% C
O2 细胞培养箱培养过夜.b. 细胞冻存：第2 d观察细胞生长状态并更换新鲜的细胞培养基. 待细胞长满培养皿时，准备冻存细胞. 首先吸掉皿中培养基，PBS清洗2遍，加入 1.5 ml 0.05%胰酶37℃消化3 min. 镜下观察有少部分细胞开始漂起时加入2 ml培养基终止消化，用1 ml移液枪轻轻吹打，使所有细胞脱离培养皿，然后将全部消化液收集到15 ml离心管中，200 g，离心4 min，去上清，加入适量的冻存液重悬细胞，每个长满的10 cm培养皿冻存4管，每管0.5 ml分装，记为P0代，将分装好的冻存管迅速转移到程序降温盒中，-80℃过夜后，转移到液氮罐中长期保存.
c. 细胞复苏：将要复苏的细胞从液氮中取出，待液氮挥发完毕后，将冻存管置于37℃水浴锅内融化，冻存管盖要保持在水面以上. 待细胞悬液融化后，将冻存管在超净工作台内打开，将悬液移于15 ml离心管内，逐滴加入培养基，边加边震荡混匀，200 g离心5 min. 去上清，加入1~2 ml培养基，用1ml移液枪吹打均匀，把细胞重悬后移入合适的培养皿或者培养板中. 用于细胞筛选的细胞移入 10 cm培养皿，加入10 ml培养基进行培养，培养条件为38.5℃，5% C
O2 . 用于体细胞核移植的的细胞移入2个24孔板，加入1 ml培养基进行培养. 次日给细胞换液，之后可每隔2 d换液.1.2.3 细胞转染筛选及鉴定
a. 电穿孔转染
分离后冻存的野生型猪胎儿成纤维细胞于 10 cm培养皿中复苏，长满90%以上时，可用于细胞筛选.
① 转染前一天，将分离的猪胎儿成纤维细胞复苏培养，更换新培养基.
② 转染当天，去除培养基，PBS清洗2遍，用 0.05% 胰酶于38℃消化3 min. 后用PFF培养基终止消化.
③ 将消化后的细胞连同培养基收集至15 ml离心管，300 g离心5 min，去除上清，用 PBS 重悬并再次离心清洗细胞，室温条件下300 g离心 3 min.
④ 去掉上清，用 PBS 重悬细胞，并调整细胞浓度至 1×10
6 .⑤ 取300 μl细胞移入电转杯，把准备好的质粒加入电转杯的细胞悬液中，轻轻混匀. 把电转杯置于电穿孔仪上，在230 V/cm和500 μF的条件下进行细胞转染.
⑥ 电转结束后，将细胞平均转移至15个 10 cm盘中，加入适量 PFF培养基，于 C
O 2 培养箱中恢复培养24 h.b. 细胞筛选
电击完成后静置电击杯1 min，然后将细胞分至到15个10 cm培养皿中，隔天换为含G418 （800 mg/L）的细胞培养基，每隔2 d换液，筛选8~10 d后在显微镜下用笔圈出单细胞克隆，然后用克隆圈挑取细胞克隆. 将消化的细胞转移到48孔板，待48孔板中细胞长满传代到24孔板，并取出约1/5的细胞裂解后作为DNA模板用于PCR鉴定，筛选出的阳性克隆待24孔板长满后传到12孔板，后冻存备用.
c. 挑取细胞克隆
准备洗净消毒好的克隆环，用PBS洗3遍后泡在PBS中备用. 取出细胞，去除培养基，用PBS洗2遍，根据画好克隆的位置放置克隆环. 在克隆环中加胰酶覆盖底部，室温下消化5 min，把克隆环中加满培养基终止反应. 将每个克隆环中的细胞尽量全部移入48孔板的一个孔中培养，第2 d换液.
d. 克隆的传代
培养于48孔板中的细胞克隆长满后需传代并取细胞进行鉴定. 具体方法：去除培养基，用PBS洗2遍，加100 μl胰酶，38℃，消化3 min，加 500 μl培养基终止反应. 用移液枪头轻轻吹打，混匀孔中细胞，取60 μl细胞于1.5 ml离心管中用于克隆鉴定，剩余的细胞移入24孔板的一个孔中培养，第2 d换液.
e. 阳性细胞克隆的鉴定
取上述装有细胞的1.5 ml离心管， 10 000 r/min，离心5 min，尽量去尽上清. 加入 10 μl NP40裂解液，涡旋振荡10 s后瞬时离心，置于烘箱中裂解，56℃、1.5 h，95℃、15 min，取出置于-20℃冰箱冷却.
以细胞裂解混合物作为模版进行PCR，PCR 产物送华大基因测序，测序结果出现基因敲除或者插入的则为阳性克隆.
1.2.4 基因敲除猪的制备
a. 供体细胞的准备
从液氮罐中取出待进行体细胞核移植的阳性细胞克隆；复苏细胞. 在显微操作前消化细胞；收集细胞到15 ml离心管中；离心，用1 ml细胞培养基重悬，备用.
b. 猪卵母细胞的体外成熟
从屠宰场收集猪卵巢置于39℃加有青霉素，链霉素的0.9%的生理盐水中，保温带回实验室. 39℃、0.9%的生理盐水冲洗后，将卵巢置于盛有少量生理盐水的烧杯中，39℃水浴保温. 使用带有12号针头的10 ml注射器将卵巢卵泡中的卵泡液吸出于50 ml的离心管中，39℃水浴保温. 全部卵巢吸完后，将吸出的卵泡液带入无菌细胞培养室，静置4 min，使卵丘卵母细胞复合物及杂质沉降至离心管底部，弃上清，加入洗卵液.
静置沉降等待的过程中，准备手吸管，取外径2.5 mm，内径2.0 mm的玻璃管，在酒精灯的外焰烧至熔化变软，边将玻璃管离开火焰，边迅速从两端拉玻璃管，将玻璃管熔化部分拉制成外径200~300 μm 的毛细管，用砂轮将毛细管断开并抛光，将玻璃管粗的一端固定于胶头滴管冒上，手吸管制作完毕. 用洗卵液洗沉降物2遍后，再用15 ml洗卵液重悬沉降物，将其转移入60 mm的培养皿中，在配有热台（热台温度调至39℃）的体式镜下用手吸管捡取卵丘卵母细胞复合物，捡取的卵母细胞外围包裹的卵丘细胞应大于3 层.
捡取的卵丘卵母细胞复合物用洗卵液和成熟液各洗1次后，转移至提前平衡好的成熟液中培养（5% C
O2 ，饱和湿度，39℃）. 每孔放置40~70枚卵丘卵母细胞复合物. 体外成熟培养42~44 h后，将卵丘卵母细胞复合物转移入39℃去卵丘操作液，涡旋震荡5 min，至卵丘细胞脱落. 将消化后的卵母细胞转移入盛有操作液的35 mm皿中，体式镜下挑取排放第一极体的卵母细胞于另一盛有操作液的35 mm皿中，39℃保存，待用. 卵母细胞成熟液：TCM-199（Gibco）加3.05 mmol/L D-葡萄糖（Sigma,G7021）,0.91 mmol/L丙酮酸钠（Sigma,P4562）,0.1% PVA（Sigma,P8136）,75 mg/L青霉素（Sigma,P3032）,50 mg/L链霉素（Sigma,S1277）,0.5 mg/L黄体化激素（Luteinizing hormone，LH，Sigma L5269）,10 μg/L表皮生长因子（EGF,Sigma,S4127）,0.5 mg/L促卵泡成熟激素（follicle stimulating hormone，FSH，Sigma,F2293）,0.57 mmol/L半胱氨酸（Sigma,C8152）,10%卵泡液.c. 制作核移植操作滴
取60 mm培养皿，在皿盖中滴上50 μl去核操作滴，排成中间一点、外圈包围5点的形状，另外在外圈滴上2小滴10% PVP，在皿中轻柔加入石蜡油，直至覆盖所有液滴.
d. 固定针和注射针的准备
注射针：取外径1.0 mm，内径0.8 mm的玻璃管固定于已调好参数的拉针仪上，按STRAT键，拉针仪将玻璃管拉开，拉制的玻璃管形变部位到尖端距离约1 cm. 取下拉制好的玻璃管，固定于断针仪上，调整玻璃管位置，使其尖端直径20 μm处与玻璃球相切，加热玻璃球，玻璃管尖端轻微颤抖时停止加热，玻璃管即在20 μm处平端断开. 将断好的玻璃管固定于磨针仪上，调整玻璃管与磨石的角度为45°，调整粗调螺旋，使玻璃管尖端靠近磨石，再调整细调螺旋，使玻璃管轻轻下压，使玻璃管细段呈现一定弧度压在磨石上，调整磨石转速到最大，磨制约10 min后，将针取下，在断针仪上进行检查，磨好的针前段斜口呈椭圆形. 将磨好的针在1%的氢氟酸中吹吸清洗，洗掉磨针过程中产生的玻璃碎屑，再用75%酒精清洗，以洗掉氢氟酸. 洗完的针固定于断针仪上，调整玻璃针位置，使其斜面背对自己靠近玻璃球. 加热玻璃球，并调整加热温度，使玻璃针斜面轻轻接触玻璃球. 玻璃针斜面顶端开始熔化时，将玻璃针拉离玻璃球即在玻璃针斜面顶端形成一个小尖，再将玻璃针距顶端5 mm处靠近玻璃球，加热，当毛细管前段因加热向玻璃球弯曲30°~40°时，停止加热，注射针制作完毕.
固定针：取外径1.0 mm，内径0.6 mm的玻璃管，在自制小酒精灯的外焰烤至熔化变软，边将玻璃管离开火焰，边迅速从两端拉玻璃管。将玻璃管熔化部分拉制成外径150~200 μm的毛细管，用砂轮将毛细管断开. 在断针仪上将毛细管断开部位靠近铂金丝上的玻璃球，加热烤钝抛光，并将内径烤制成20 μm，再将毛细管距顶端5 mm处靠近玻璃球，加热，当毛细管前段因加热向玻璃球弯曲 30°~40°时，停止加热，固定针制作完毕.
e. 卵母细胞去核和供体细胞卵周隙注射
准备工作：将固定针和注射针分别固定到相对应的操作臂上，在镜下调整好位置后，升起固定针，将核移植操作滴所在的60 mm皿盖置于镜下，将注射针转移到10% PVP滴中，不断吸吐近10次，将注射针清洗干净，使石蜡油和液体在针内流畅地流动.
卵母细胞去核和供体细胞卵周隙注射：将50~80个卵用手吸管转移到去核操作滴中，将供体细胞加到中间的去核操作滴中，用注射针挑选形态规则、相差较大的细胞，吸到针内备用. 固定针轻轻吸住卵母细胞，用注射针拨动卵母细胞寻找极体，最后将极体定位到4、5点钟方向，注射针在3点钟方向进针，吸出极体以及周围的部分胞质，再将一个供体细胞沿刚才的针孔注入卵周隙中，抽出注射针，轻轻挤压卵母细胞，使卵母细胞和供体细胞接触. 松开处理过的卵，固定下一个未处理过的卵，重复以上步骤. 整个过程在38.5℃热台上操作.
f. 卵母细胞和供体细胞融合以及重构胚胎激活
将去核卵母细胞-供体细胞复合物转移至操作液中，取30~50个置于含融合液的小皿中平衡，去核卵母细胞-供体细胞复合物首先飘起到液面，之后慢慢沉到皿底，表明平衡完成. 同时，打开融合仪，设置参数为120 V/mm、30 μs、2次，将两个电极夹到融合槽的两极，加入融合液冲洗1次融合槽，最后置于60 mm培养皿中，加入融合液，直至融合液没过融合槽的两个平行电极之间的空隙，两条电极之间间隔为1 mm.
将平衡好的卵母细胞-供体细胞复合物置于两个电极中间，用新做的拨卵针拨动卵母细胞-供体细胞复合物，使去核卵母细胞和供体细胞的接触面平行于两个电极，最后按开关进行电脉冲处理. 将处理过的卵母细胞-供体细胞复合物转移至操作液滴中，静置15~20 min后，在体视镜下，用拨卵针挑选出融合的重构胚.
g. 重构胚胎的体外培养
PZM-3培养基平衡：将PZM-3培养基按每孔0.5 ml加入四孔板中，加入石蜡油覆盖液体表面，另取小皿两个，在皿底滴上300 μl PZM-3培养基液滴3个，加入石蜡油覆盖表面，将四孔板和小皿置于5% C
O2 、38.5℃、100%湿度的恒温培养箱平衡过夜.重构胚胎培养：将挑选的融合重构胚在小皿滴中洗涤3遍后，将重构胚胎加入四孔板中，置于5% C
O2 、38.5℃、100%湿度的恒温培养箱中培养.h. 卵裂率、囊胚率以及囊胚细胞数检测方法
卵裂率：重构胚胎培养48 h后，在显微镜下观察，记录卵裂胚胎个数，其与培养重构胚的比例即为卵裂率. 囊胚率：在显微镜下观察，记录重构胚胎发育到囊胚的个数，其与培养重构胚的比例即为卵裂率. 囊胚细胞数检测：取一洁净的手吸管，在体视镜镜下将囊胚从PZM-3培养基中吸出后，转移到4%的多聚甲醛溶液中固定5~10 min，在操作液中清洗一遍后将囊胚转移到Hoechst 33342染液中，染色10 min，最后将囊胚从Hoechst 33342转移到操作液中，用锡纸包住48孔板，4℃过夜，以保证洗去背景染色. 第二天，取洁净的载玻片，在中央滴5 μl的抗荧光淬灭封片液，将囊胚转移到封片液中，在囊胚所在位置用记号笔标记. 打开电脑、显微镜以及荧光激发器，打开荧光成像软件，调整焦距，拍下囊胚荧光图片，再打开明场，拍下明场照片，再用画图软件打开荧光照片，记录每个囊胚细胞数.
i. 胚胎移植
待受体猪呼吸平稳进入深度麻醉状态时进行手术. 在倒数第一对和倒数第二对乳头之间开口8 cm左右，将卵巢输卵管慢慢牵出腹腔，观察卵巢排卵情况，并找到输卵管的伞部用镊子进行固定. 将装好的胚胎移植管，从输卵管伞部慢慢伸入输卵管. 胚胎移植完成后，将输卵管伞重新包回卵巢，将卵巢输卵管送回腹腔. 以生理盐水冲洗创口后进行缝合.
j. 代孕受体的妊娠诊断
胚胎移植后24~26 d进行B超监测妊娠情况，并对怀孕受体每隔1周进行一次B超监测，追踪核移植胚胎发育情况.
k. 新生克隆猪的基因型鉴定
新生克隆猪在出生后1周剪取耳组织，利用组织基因组提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取克隆猪基因组DNA，基因组提取见试剂盒说明书. 以提取的基因组为模板，进行PCR，PCR产物进一步酶切和测序鉴定.
2 结果与分析
2.1 Tiki1基因靶位点的选择
我们根据贺熹教授团队提供的人Tiki1基因的完整的cDNA序列，在猪的基因组数据库里比对，发现预测的猪Tiki1基因位于第3号染色体上， 其预测的外显子4序列与人Tiki1基因的同源性 最高，因此我们在预测的猪Tiki1基因外显子4上选择2个靶位点进行猪Tiki1基因的敲除：以下序列为预测的猪Tiki1基因的整个外显子4，带 下划线的碱基序列为靶位点序列，斜体加粗标 记的碱基为PAM 区（图1）；其中GCGATCCGTGTCCGTACACCCGG命名为靶位点g1,GCCCCAGGGTGAGAACCTCCAGG命名为靶位点g2.
Fig. 1 Target site of Tiki1 gene
TGCTCAAGTTCCTGACCCTCCCTAGCATATCTCCATGTTGTCACTTTTCCTTTTAGCAAAGTGAATTGAATTCCTTCTTGTG GACCATCAAGCGAGACCCACCGTCTTACTTCTTTAGCGCGATCCGTGTCCGTACACCCGGGTTTGGGACTTCATCCCTG ACAACTCCAAGGAGGCTTTCCGGCAGAGCTGGACCTCATGGACCCCTCTACCATCTCAGCTCTCACCAGCTGTCAGATGC TGCCCCAGGGTGAGAACCTCCAGGACATGCTCCCCAGGGACATCTACTGCCATCTCAAGCGCCACCTAGAGAACGTCA AGCTCATGATGCCCTCATGGATGACTCCTGACCAGCGCCGGAAGGGTCTCTATGCAGACTACCTCTTCAGTGCCATTGCTG GGAACTGGGAGTGGAAGAGGCCCATCTGGATCATGCTCATGATCAACTCCCTGACCGAAGCGTACACCAAGTCCCGTGG GGTGCCCGTCTTAGACCTGTGCCTTGCCCAGGAGGCCAAGCGGCTGAGGAAACAGACGGGGGCAGTGGAGAAGGTGGA AGAGCAGTGTCATCCCTTGAATGGGCTGAACTTTTCGCAAGAAAGATCCTCTTTGTTTGCAGGACTTGGTGGCAGTTGAT GGTGTAGCTGGGCCTATTGC 2.2 Tiki1基因打靶细胞的转染和筛选
分别将大提好的Cas9质粒和gRNA-g1或者gRNA-g2质粒各25 μg混合后共转染原代巴马猪胎儿成纤维细胞PFF中，进行为期10 d左右的G418筛选，挑取一定数量的细胞克隆进行PCR扩增后测序鉴定. 针对靶位点g1，我们总共挑取了22个细胞克隆，PCR测序鉴定了22个，选择其中测序结果为单峰且无野生型序列（表明细胞只有一种敲除方式，称为纯合双敲除）的5个阳性细胞克隆冻存备用；针对靶位点g2，我们总共挑取了30个细胞克隆，PCR测序鉴定了28个，选择其中测序结果为纯合双敲除的3个阳性细胞克隆冻存备用. 以上选择冻存备用的8个阳性细胞克隆的具体突变方式见图2，其突变范围从1 bp的插入到8 bp的缺失不等. 带下划线的碱基序列为靶位点序列，斜体加粗标记的碱基为PAM区，空心字母代表插入的碱基.
Fig. 2 Sequencing results of positive cell clones screened
WT-1 CACCGTCTTACTTCTTTAGCGCGATCCGTGTCCGTACACCCGGGTTTGGGACTTCATC Target-g1 1-1 CACCGTCTTACTTCTTTAGCGCGATCCGTGTCCGTAC-CCCGGGTTTGGGACTTCATC -1 bp 1-2 CACCGTCTTACTTCTTTAGCGCGATCCGTGTCCGTACCACCCGGGTTTGGGACTTCATC +1 bp 1-8 CACCGTCTTACTTCTTTAGCGCGATCCGTGTCCGT--ACCCGGGTTTGGGACTTCATC -2 bp 1-12 CACCGTCTTACTTCTTTAGCGCGATCCGTG--------CCCGGGTTTGGGACTTCATC -8 bp 1-19 CACCGTCTTACTTCTTTAGCGCGATCCGTGTC----CACCCGGGTTTGGGACTTCATC -4 bp WT-2 CTCACCAGCTGTCAGATGCTGCCCCAGGGTGAGAACCTCCAGGACATGCTCCCCAGGG Target-g2 2-2 CTCACCAGCTGTCAGATGCTGCCCCAGGGTGAGAA--TCCAGGACATGCTCCCCAGGG -2 bp 2-10 CTCACCAGCTGTCAGATGCTGCCCCAGGGTGAGAA--TCCAGGACATGCTCCCCAGGG -2 bp 2-28 CTCACCAGCTGTCAGATGCTGCCCCAGGGTGAGAAC-TCCAGGACATGCTCCCCAGGG -1 bp 2.3 Tiki1基因打靶克隆猪的生产
我们将筛选到的Tiki1基因打靶阳性细胞进行体细胞核移植，过夜培育后将重组胚移植入代孕母猪，自然妊娠约114 d后产仔. 我们总共移植了720个重组胚胎，分别植入3头代孕母猪(移植统计见表1). CRISPR/Cas9系统存在一定的脱靶效应，但是因为筛选到的阳性细胞克隆其体外扩增有限，无法获得足量的基因组进行潜在脱靶位点的检测，因此我们通过筛选到的靶位点g1（5个阳性细胞克隆）和g2（3个阳性细胞克隆）的不同阳性克隆的细胞进行核移植获得重组胚胎，以混合方式移植代孕母猪，以降低某些细胞克隆因潜在的脱靶效应可能导致无法获得存活个体的概率. 其中代孕母猪耳号为927母猪，经B 超检测成功怀孕到期，并产下总共13头克隆仔猪其中包括10头成活的克隆猪和3头死胎（图3），3头死胎外观没有任何缺陷，解剖后观察期内部生理解剖均无异常，10头存活仔猪均无外观异常及其他生理缺陷，截至写稿日，已健康存活1年多；另外2头代孕母猪在移植后26天进行B超检测均未发现妊娠现象.
2.4 Tiki1基因打靶克隆猪测序结果
我们对新生的13头克隆猪在出生后剪取耳组织，利用组织基因组提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取克隆猪基因组DNA，基因组提取见试剂盒说明书. 以提取的基因组为模板，进行PCR，PCR产物进一步测序鉴定. 测序结果见图4. 其中#1、3、5、6、8、10和13克隆仔猪的Tiki1基因敲除位点在靶位点g1处，克隆猪#1和10敲除方式同阳性细胞克隆1-1、克隆猪#3和13敲除方式同阳性细胞克隆1-8、克隆猪#5、6和8敲除方式同阳性细胞克隆1-2；除了#7号为野生型外，其余的 #2、4、9、11和12号克隆仔猪的Tiki1基因敲除位点在靶位点g2处，其敲除方式均同阳性细胞克隆2-10. 说明构建的克隆猪确实来自筛选的阳性细胞克隆. 从实验结果，我们可以看出，筛选到的阳性单细胞克隆仍混有一定的野生型细胞，此外，阳性细胞克隆1-12、1-19、2-2和2-28均未获得克隆猪. 带下划线的碱基序列为靶位点序列，红色标记的碱基为PAM区，蓝色字母代表插入的碱基.
Fig. 4 Sequencing results of target cloning pigs with Tiki1 gene
Target-g1 CACCGTCTTACTTCTTTAGCGCGATCCGTGTCCGTACACCCGGGTTTGGGACTTCATC WT Target-g2 CTCACCAGCTGTCAGATGCTGCCCCAGGGTGAGAACCTCCAGGACATGCTCCCCAGGG WT #1 CACCGTCTTACTTCTTTAGCGCGATCCGTGTCCGTAC-CCCGGGTTTGGGACTTCATC -1 bp #2 CTCACCAGCTGTCAGATGCTGCCCCAGGGTGAGAA--TCCAGGACATGCTCCCCAGGG -2 bp #3 CACCGTCTTACTTCTTTAGCGCGATCCGTGTCCGT--ACCCGGGTTTGGGACTTCATC -2 bp #4 CTCACCAGCTGTCAGATGCTGCCCCAGGGTGAGAA--TCCAGGACATGCTCCCCAGGG -2 bp #5 CACCGTCTTACTTCTTTAGCGCGATCCGTGTCCGTACCACCCGGGTTTGGGACTTCATC +1 bp #6 CACCGTCTTACTTCTTTAGCGCGATCCGTGTCCGTACCACCCGGGTTTGGGACTTCATC +1 bp #7 CACCGTCTTACTTCTTTAGCGCGATCCGTGTCCGTACACCCGGGTTTGGGACTTCATC WT #8 CACCGTCTTACTTCTTTAGCGCGATCCGTGTCCGTACCACCCGGGTTTGGGACTTCATC +1 bp #9 CTCACCAGCTGTCAGATGCTGCCCCAGGGTGAGAA--TCCAGGACATGCTCCCCAGGG -2 bp #10 CACCGTCTTACTTCTTTAGCGCGATCCGTGTCCGTAC-CCCGGGTTTGGGACTTCATC -1 bp #11 CTCACCAGCTGTCAGATGCTGCCCCAGGGTGAGAA--TCCAGGACATGCTCCCCAGGG -2 bp #12 CTCACCAGCTGTCAGATGCTGCCCCAGGGTGAGAA--TCCAGGACATGCTCCCCAGGG -2 bp #13 CACCGTCTTACTTCTTTAGCGCGATCCGTGTCCGT--ACCCGGGTTTGGGACTTCATC -2 bp 3 讨论
目前关于Tiki1基因研究的报道还非常少，最先是2012年由贺熹团队在《细胞》杂志(Cell)杂志上报道的. 他们在爪蟾上的研究发现，Tiki1基因缺失导致爪蟾胚胎缺失头部、胚胎致死、无法获得存活个体，其表达模式和功能与Wnt信号通路的抑制因子DKK1非常相似；他们进一步证明了Tiki1也是Wnt信号通路的抑制因子，通过切割Wnt蛋白氨基端区域使特定的Wnt配体失
活[6] . 在本研究中，敲除Tiki1基因不仅没有出现猪胚胎头部缺失等发育异常和胚胎致死等表型，而且可以获得存活的健康基因敲除猪模型，这与爪蟾上的研究结果不一致. 以上结果表明，Tiki1基因缺失不会影响猪的胚胎发育，其在哺乳动物猪上的功能不同于其在爪蟾上的功能，猜测可能是Tiki1基因在物种进化上的不保守性造成的. 虽然在爪蟾上的研究结果表明Tiki1基因的功能类似DKK1，但Tiki1基因在小鼠等啮齿类动物中天然缺失，而DKK1基因不但存在于小鼠中，而且功能与在爪蟾上的一致，都对头部诱导起决定作用，其缺失都导致胚胎致死[2,3] ，这至少说明Tiki1基因在哺乳动物的功能与DKK1的功能是有差异的，这也许是解释Tiki1基因敲除猪表型正常的一个潜在理由.Tiki1基因缺失在爪蟾和猪上表型的不一致现象，与Cerberus基因缺失在爪蟾上和其同源基因Cer-l缺失在小鼠上的表型不一致现象非常相似. Cerberus蛋白在爪蟾上被证明为Wnt信号通路的抑制因子，对爪蟾的头部形成具有重要作用，当把小鼠的该同源基因（mouse Cerberus like，mCer-l）的mRNA注射到爪蟾胚胎中，可以诱导巨大的背前结构和短小的体轴结构，其功能类似爪蟾的Cerberus基
因[11,12] . 但是在小鼠上的研究结果发现，mCer-l蛋白并非Wnt信号通路的抑制因子，而是Nodal和BMP信号通路的抑制因子. 此外，mCer-l基因缺失小鼠的胚胎可以正常发育，这不同于爪蟾中Cerberus基因缺失导致的头部发育异常和胚胎致死等表型，并且mCer-l基因缺失纯合小鼠具有正常的繁殖力，可繁殖出健康后代[13,14] . 虽然到目前为止还没找到导致这种基因在不同物种功能差异的分子机制，但Tiki1基因在爪蟾等低等动物和哺乳动物中的功能模式有可能与Cerberus相同. 还有一种导致Tiki1基因缺失但不会造成猪表型异常的原因，可能是在猪等哺乳动物中存在其他可以替代Tiki1基因功能或者弥补Tiki1基因缺失的基因，就像BMP信号通路中chordin和noggin间的相互补偿作用一样[15] . 关于Tiki1基因在哺乳动物中的具体功能和机理，有待于在我们利用CRISPR/Cas9系统构建的Tiki1基因修饰猪模型的基础上继续开展进一步的研究.LAI Liang-Xue. Tel: 86-20-32015304， E-mail: lai_liangxue@gibh.ac.cn
YAN Quan-Mei. Tel: 86-20-32015304， E-mail: yan_quanmei@gibh.ac.cn
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摘要
Tiki1基因是哈佛大学儿童医学院贺熹教授实验室发现的一个对蛙头部的诱导起到决定性作用的新基因，但Tiki1基因在小鼠等啮齿类动物中缺失，因此无法利用小鼠等小动物来研究其在哺乳动物中的作用. 本文利用CRISPR/Cas9系统结合体细胞克隆技术构建Tiki1基因修饰猪模型，研究Tiki1基因在猪发育中的作用. 我们利用贺熹教授团队提供的人Tiki1基因序列，在猪的基因组数据库中比对出与其同源性最高的一段序列设计2个靶位点（g1和g2）. 以设计的靶位点构建打靶质粒转染猪胎儿成纤维细胞，经细胞筛选、PCR扩增及测序共鉴定了52个单细胞克隆株. 最终选择靶位点g1为纯合双敲的5个单细胞克隆株和靶位点g2为纯合双敲的3个单细胞克隆株作为构建Tiki1基因敲除猪的核供体. 我们共计构建了720个重组胚胎，分别植入3头代孕母猪，其中有1头经B超检测成功怀孕并妊娠到期产下13头发育正常的克隆猪，经测序鉴定其中12头为Tiki1基因双敲除猪模型， Tiki1基因敲除克隆猪健康存活至今. 结果表明Tiki1基因对于猪早期发育的作用机理不同于蛙，其在猪早期发育的过程中的具体作用机理有待后续进一步的深入研究.
Abstract
Tiki1 gene, found and named by Professor He Xi's team from Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, plays a key role in the formation of head in Xenopus. However, as Tiki1 gene is absent in rodents such as mice, it is impossible to use mice or rat to study its role in mammals. In this study, we generated Tiki1 gene modified pigs using CRISPR/Cas9 system combined with somatic cell cloning technology to study the role of Tiki1 gene in pig development. Aligned the human Tiki1 mRNA sequence provided by professor He Xi's team with the pig genome database, we selected two target sites (g1 and g2) with the top 2 highest sequence identity at the predicted pig Tiki1 gene locus. The sgrRNA plasmid was constructed to transfect porcine fetal fibroblasts, and 52 single cell clones were screened and sequenced. We finally selected 5 single-cell clones with biallelic knockout mutations at target site g1 and 3 single-cell clones with biallelic knockout mutations at target site g2 as nuclear donors for constructing Tiki1 knockout pigs. A total of 720 recombinant embryos were constructed and transferred into three surrogate sows and one of them was successfully pregnant monitored by B ultrasound. A total of 13 cloned piglets (ten living piglets and 3 dead piglets ) were produced, and 12 of them were biallelic knockout mutations at Tiki1 locus. Both the living and dead Tiki1 gene knockout cloned piglets were developed normally and the living piglets have survived healthy till now. The results indicate that the role of Tiki1 gene on early development of pigs is different from that of frogs. The specific role of Tiki1 gene in the early development of pigs needs to be further investigated.
赖良学. Tel：020-32015304,E-mail:lai_liangxue@gibh.ac.cn
颜泉梅. Tel：020-32015304,E-mail:yan_quanmei@gibh.ac.cn
Wnt信号通路在动物的生长发育过程中，决定细胞的极性、命运、前体细胞的增殖、体轴的建立，以及细胞的不对称分裂
为了研究Tiki1基因在哺乳动物发育中的作用，本文选择猪为动物模型，采用CRISR/Cas9技术和体细胞克隆技术构建Tiki1基因敲除的猪模型，分析猪体敲除Tiki1基因是否会导致猪胚胎缺失脑部结构或其他异常表型，为挖掘Tiki1基因在哺乳动物发育过程中的功能提供一定的参考依据.
